Was sind die effektivsten Methoden, um Ihre Proben für das Western Blot vorzubereiten?

1 Sammeln von Proben

Der erste Schritt, um Ihre Proben für das Western Blot vorzubereiten, besteht darin, sie richtig zu sammeln. Abhängig von der Art und Herkunft Ihrer Proben müssen Sie möglicherweise unterschiedliche Methoden und Werkzeuge verwenden, um sie zu gewinnen und zu konservieren. Wenn du zum Beispiel mit tierischem oder menschlichem Gewebe arbeitest, musst du möglicherweise chirurgische Instrumente, Scheren oder Biopsiestanzen verwenden, um sie zu schneiden und zu wiegen. Wenn Sie mit Zellen arbeiten, müssen Sie möglicherweise Trypsin, Zentrifugation oder Pipettieren verwenden, um sie abzutrennen und zu sammeln. In jedem Fall sollten Sie Ihre Proben immer schonend und schnell behandeln und jegliche Kontamination oder Degradation vermeiden.

2 Lagerung von Proben

Der nächste Schritt, um Ihre Proben für das Western Blot vorzubereiten, besteht darin, sie entsprechend zu lagern. Abhängig von der Stabilität und Empfindlichkeit der gewünschten Proteine müssen Sie möglicherweise unterschiedliche Temperaturen und Zusatzstoffe verwenden, um deren Verlust oder Veränderung zu verhindern. Wenn Sie beispielsweise mit Proteinen arbeiten, die anfällig für Proteolyse, Oxidation oder Phosphorylierung sind, müssen Sie möglicherweise Protease-Inhibitoren, Antioxidantien oder Phosphatase-Inhibitoren in Ihrem Speicherpuffer verwenden. Wenn Sie mit Proteinen arbeiten, die instabil oder flüchtig sind, müssen Sie möglicherweise niedrige Temperaturen wie -80 °C oder flüssigen Stickstoff verwenden, um sie einzufrieren. In jedem Fall sollten Sie Ihre Proben immer klar beschriften und wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen vermeiden.

3 Lysen von Proben

Der dritte Schritt zur Vorbereitung Ihrer Proben für das Western Blot besteht darin, sie effektiv zu lysen. Abhängig von der Zusammensetzung und Komplexität Ihrer Proben müssen Sie möglicherweise unterschiedliche Methoden und Reagenzien verwenden, um die Membranen aufzubrechen und die Proteine freizusetzen. Wenn Sie beispielsweise mit Geweben arbeiten, müssen Sie möglicherweise mechanische Methoden wie Homogenisierung, Beschallung oder Kügelchenschlagen anwenden, um die Gewebestruktur zu zerstören. Wenn Sie mit Zellen arbeiten, müssen Sie möglicherweise chemische Methoden wie Detergenzien, Salze oder chaotrope Mittel verwenden, um die Zellmembranen zu lösen. In jedem Fall sollten Sie immer eine Lysemethode und einen Puffer wählen, die mit Ihren interessierenden Proteinen und Ihren nachgeschalteten Anwendungen kompatibel sind.

5 Laden von Proben

Der letzte Schritt, um Ihre Proben für das Western Blot vorzubereiten, besteht darin, sie richtig zu laden. Abhängig von der Größe und Ladung der gewünschten Proteine müssen Sie möglicherweise unterschiedliche Volumina und Zusatzstoffe verwenden, um sie durch Elektrophorese zu trennen. Wenn Sie beispielsweise mit großen oder sauren Proteinen arbeiten, müssen Sie möglicherweise geringe Mengen und hohe Konzentrationen von Reduktionsmitteln wie Dithiothreitol verwenden (DVB-T) oder Beta-Mercaptoethanol (BME), um sie zu denaturieren und zu reduzieren. Wenn Sie mit kleinen oder basischen Proteinen arbeiten, müssen Sie möglicherweise hohe Mengen und niedrige Konzentrationen von Ladepuffern verwenden, wie z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Bromphenolblau, um sie zu beschichten und sichtbar zu machen. In jedem Fall sollten Sie immer einen geeigneten Molekulargewichtsmarker und eine Positivkontrolle verwenden, um Ihre Proben zu vergleichen und zu verifizieren.

6 Hier erfahren Sie, was Sie sonst noch beachten sollten

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