Contaminación por Mycoplasma en Cultivos Celulares: Causas, Problemas y Soluciones
Nimsi Elsa Enciso
Gerente de Ventas Directas, Industria y Web | Comercialización y Distribución
Cultivos: causas, problemas y soluciones
La contaminación por Mycoplasma de sus cultivos celulares puede afectar seriamente la confiabilidad, reproducibilidad y consistencia de sus resultados experimentales. Presenta un gran desafío para la investigación, así como para la fabricación de bioproductos.
La contaminación por Mycoplasma es difícil de detectar y, por lo tanto, su presencia puede pasar desapercibida durante meses. De hecho, se estima que más del 10 % de todos los cultivos celulares están contaminados con especies de Mycoplasma(1). Esto muestra la importancia de las pruebas de rutina para asegurarse de que está trabajando con cultivos no contaminados. Aquí, analizamos los desafíos y los mejores enfoques para detectar, eliminar y prevenir la contaminación por Mycoplasma, incluida una amplia gama de preguntas y respuestas comunes sobre cómo superar el problema.
¿Qué es el Mycoplasma?
Las especies de Mycoplasma pertenecen a la clase Mollicutes, que incluye Acholeplasma y Ureaplasma, entre otros. Los mollicutes son bacterias grampositivas pero, a diferencia de otras especies, carecen de pared celular y, por lo tanto, pueden adoptar varias formas diferentes. Por conveniencia, el término Mycoplasma se usa a menudo para referirse a todas las especies de la clase Mollicutes.
Las especies de Mycoplasma están muy extendidas en la naturaleza como parásitos de mamíferos (incluidos los humanos), reptiles, insectos y plantas. Son los procariotas autorreplicantes más pequeños y simples con un tamaño de solo 0,2 a 0,8 µm. Con un genoma de solo 0,58–2,20 Mb, las especies de Mycoplasma tienen capacidades biosintéticas limitadas y, por lo tanto, dependen de sus huéspedes para obtener la mayoría de los nutrientes.
¿De dónde viene la contaminación por Mycoplasma?
Hay seis especies que representan el 95 % de todas las contaminaciones por micoplasma detectadas en cultivos de líneas celulares continuas: M. orale, M. arginini, M. fermentans, M. hyorhinis, M. hominis y A. laidlawii (2). Las rutas típicas de contaminación son: contaminación cruzada de otras células (por ejemplo, a través de aerosoles generados durante el pipeteo), uso de las mismas botellas de medios o manipulación de más de un tipo de célula a la vez.
Otras fuentes de contaminación dentro de sus cultivos celulares podrían incluir la contaminación directa del investigador, así como el uso de materiales contaminados, como sueros de animales. El alto riesgo de contaminación resalta la importancia de comprar siempre medios de cultivo celular de alta calidad de fabricantes acreditados.
¿Cómo puede afectar la contaminación por Mycoplasma a mis cultivos celulares?
La contaminación de cultivos celulares con especies de Mycoplasma puede afectar sus células de muchas formas, la mayoría de las cuales reducirán la confiabilidad, reproducibilidad y consistencia de sus resultados experimentales. El tipo y la gravedad de estos efectos a menudo dependerán del tipo de célula que esté utilizando. Algunos de los efectos generales observados en las células eucariotas pueden incluir:
Alteraciones en los niveles de síntesis de proteína, ARN y ADN debido a la privación de nutrientes
La contaminación con ciertas especies de Mycoplasma también puede causar efectos citopáticos, caracterizados por retraso en el crecimiento, crecimiento anormal y células degeneradas, probablemente debido a la promoción o inhibición de la apoptosis (3). Este es un problema importante para la investigación, así como durante la fabricación y el procesamiento de productos biológicos y biofarmacéuticos porque la contaminación puede dar como resultado una reducción de los rendimientos o la pérdida de un lote completo del producto. Además, las células de hibridoma, generalmente generadas para respaldar aplicaciones como la fabricación de anticuerpos, pueden mostrar efectos característicos cuando se contaminan con Mycoplasma, como la inhibición de la fusión celular y un menor rendimiento de anticuerpos monoclonales (4).
¿Cómo puede detectar la contaminación por Mycoplasma en sus cultivos celulares?
Lamentablemente, es un desafío detectar de manera rápida y confiable la contaminación por Mycoplasma en cultivos celulares. Una de las razones es que la contaminación por Mycoplasma no suele desencadenar los cambios de turbidez que son comunes con otros tipos de contaminación bacteriana o fúngica. Además, las bacterias son demasiado pequeñas para observarlas mediante microscopía óptica sin necesidad de un etiquetado específico.
Sin embargo, los cultivos celulares pueden mostrar cambios sutiles como resultado de la contaminación por Mycoplasma, lo que significa que un análisis cuidadoso puede brindar cierta información. Por ejemplo, como el Mycoplasma competirá con sus células por los nutrientes del medio de cultivo, uno de los primeros signos visibles de contaminación es una tasa reducida de proliferación celular. Otros indicios de contaminación incluyen agregación celular, cambios morfológicos y eficiencias de transfección deficientes (que pueden ser más fáciles de detectar cuando se trabaja con células que solían mostrar una alta eficiencia de transfección en el pasado).
La única forma de detectar especies de Mycoplasma es realizar pruebas explícitas para detectarlas. Existen varias técnicas diferentes para identificar si sus cultivos celulares están contaminados con Mycoplasma. Estos incluyen tinción histoquímica, ELISA, tinción con fluorocromo de ADN, cultivo microbiológico, métodos bioquímicos y PCR (5). Recientemente, un grupo de investigación incluso logró mostrar la presencia de especies de Mycoplasma mediante microscopía de luz utilizando iluminación oblicua, lo que hace que las células de Mycoplasma sean visibles como focos blancos debido a la dispersión de la luz (6).
Los mejores ensayos son muy sensibles y específicos, pero también se pueden realizar rápidamente. Sobre la base de estos criterios, discutimos los ensayos más utilizados a continuación.
Uso de PCR para detectar la contaminación por Mycoplasma
La PCR es una técnica poderosa para amplificar secuencias específicas de ADN en una muestra y es un método sensible y rápido para identificar la contaminación por micoplasma en sus cultivos celulares. Sin embargo, existe el riesgo de propagar la contaminación del control positivo (o cualquiera de sus muestras que previamente dio positivo para Mycoplasma) a las muestras no afectadas durante el proceso de análisis, lo que genera resultados falsos positivos. Si bien hay muchos kits de detección de PCR disponibles comercialmente, muchos no pueden detectar todas las especies de Mycoplasma.
Métodos basados en cultivos para la detección de micoplasmas
Hay varios métodos de cultivo estándar disponibles para la detección de Mycoplasma. Estos son:
Este enfoque implica cultivar el contaminante en caldo, sembrar las células en placas de agar nutritivo y luego identificar si la contaminación se debe a Mycoplasma de las colonias formadas. Este método es altamente específico y sensible.
En este método, el contaminante bacteriano se cultiva en un cultivo celular de "prueba", un cultivo que se sabe que soporta altos niveles de proliferación de micoplasmas. Para identificar si es probable que el contaminante sea Mycoplasma, el ADN bacteriano se tiñe con fluorescencia (7). Si bien es muy sensible, esta técnica tiene una especificidad limitada para el ADN de Mycoplasma.
Es posible utilizar células especialmente diseñadas para detectar la presencia de Mycoplasma en cultivos celulares. Estas "células sensoras" detectan células de Mycoplasma a través de su receptor tipo toll (TLR) 2. En presencia de especies de Mycoplasma, este receptor se activa y desencadena una cascada de señalización, cuyo resultado es un cambio de color observable. Este es un método altamente sensible pero tiene baja especificidad en comparación con otros métodos.
Los productos biológicos fabricados y autorizados producidos a través de sustratos celulares (p. ej., vacunas virales, anticuerpos monoclonales y productos similares) deben analizarse mediante los métodos (1) y (2) anteriores para garantizar la ausencia de contaminación por Mycoplasma; este es un requisito para la regulación por Mycoplasma. pruebas. En estos ensayos también es necesario un control positivo con bacterias micoplasmáticas vivas y/o células contaminadas. Cuando el uso de un control positivo pueda comprometer la esterilidad de un laboratorio, puede ser preferible subcontratar las pruebas de Mycoplasma.
Las especies de Mycoplasma producen enzimas que no se encuentran en los eucariotas. Esto permite detectarlos buscando la presencia de estas enzimas en cultivos celulares. Un kit diseñado para esto es el MycoAlertTM PLUS Mycoplasma Detection Kit, que contiene la enzima luciferasa como indicador. Este método funciona de la siguiente manera: primero se lisan las células de micoplasma, liberando sus enzimas. Estas enzimas reaccionan con el sustrato del kit, que cataliza la conversión de ADP a ATP. Luciferase usa este ATP para crear una señal de luz, que luego se puede detectar usando un luminómetro. Este es un método rápido para identificar la presencia de especies de Mycoplasma en cultivos celulares.
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También es posible detectar ADN de micoplasma mediante microscopía de fluorescencia utilizando una tinción de ADN no específica (8). Esta tinción se agrega al medio de cultivo y la presencia de ADN de micoplasma puede confirmarse mediante la aparición de focos brillantes/pequeños grupos entre las células, cuando se observan con un microscopio de fluorescencia.
¿Debería preocuparse si sus cultivos celulares están contaminados con Mycoplasma?
Todos los contaminantes de cultivos celulares pueden ser problemáticos, pero en comparación con otros tipos de contaminantes bacterianos y fúngicos, la contaminación por micoplasma suele ser más difícil de detectar. Esto se debe a que los Mycoplasma son muy pequeños y se replican a un ritmo más lento en comparación con muchas otras especies bacterianas.
La presencia de Mycoplasma en sus cultivos celulares puede afectar seriamente el comportamiento de sus células, haciendo que sus resultados no sean confiables ni reproducibles. Entendemos lo frustrante que es descubrir que sus cultivos están contaminados, especialmente porque es posible que tenga que configurar otro cultivo y/o repetir cualquier experimento realizado desde la última prueba negativa de Mycoplasma. Sin embargo, si desea obtener datos precisos que sean lo más representativos posible de su sistema modelo, generalmente es mejor descartar los cultivos contaminados y preparar otros nuevos.
Puede continuar con sus experimentos desde la última prueba negativa de Mycoplasma. Revise las pautas para el trabajo estéril, incluido el mantenimiento de su equipo en las mejores condiciones para reducir los riesgos de contaminación por Mycoplasma, por ejemplo, en sus incubadoras y baños de agua. Esto identificará dónde puede mejorar sus instalaciones y procedimientos, ayudándole a reducir los riesgos de una futura contaminación por Mycoplasma.
¿Qué opciones tiene cuando sus cultivos celulares están contaminados con Mycoplasma?
Desechar sus cultivos celulares contaminados puede parecer una respuesta obvia a la contaminación por Mycoplasma. Sin embargo, si está utilizando un cultivo que ya no puede obtener, o que es particularmente valioso, podría valer la pena tratar de eliminar la contaminación. Tenga en cuenta que el tratamiento para deshacerse de Mycoplasma puede llevar semanas, si no más.
La eliminación de la contaminación por Mycoplasma se puede llevar a cabo mediante el uso de reactivos especialmente formulados, como MycoZapTM Mycoplasma Elimination Reagent. Esta herramienta combina agentes antibióticos y antimetabólicos para eliminar la contaminación por Mycoplasma detectable en tan solo cuatro días. Se ha optimizado para eliminar la contaminación con efectos mínimos en su cultivo celular. Se pueden encontrar más detalles sobre la eliminación de especies de Mycoplasma en la siguiente sección.
¿Puede eliminar el Mycoplasma de sus cultivos celulares? Si es así, ¿cómo?
Existen varios métodos para eliminar la contaminación por Mycoplasma. Estos se dividen en una de cuatro categorías: quimioterapéuticos, químicos, inmunológicos y físicos. Las técnicas de eliminación incluyen el tratamiento con antibióticos, la exposición a detergentes, la exposición al complemento, la clonación celular, el tratamiento térmico y la filtración (9). Desafortunadamente, se ha demostrado que muchas de estas técnicas no son confiables, ya que no pueden matar todas las especies de Mycoplasma. También consumen mucho tiempo y no son muy eficientes para eliminar la contaminación. El tratamiento con antibióticos, por ejemplo, ha mostrado resultados prometedores en líneas celulares de leucemia-linfoma contaminadas con Mycoplasma. Sin embargo, en el 3-20 % de los cultivos, las bacterias del Mycoplasma fueron resistentes y en el 3-11 % de los tratamientos se observó citotoxicidad (9).
Si los antibióticos no pueden eliminar la contaminación por Mycoplasma, los agentes antimicrobianos bacteriostáticos podrían ayudar a inhibir el crecimiento de la bacteria. Otro enfoque sería probar primero un antibiótico y, si esto no es efectivo, usar otro antibiótico en un cultivo positivo de respaldo (es decir, uno que haya almacenado por separado, antes de su primer intento de eliminar la contaminación).
La eliminación de la contaminación por Mycoplasma también se puede lograr mediante el uso de reactivos especialmente formulados, como el reactivo de eliminación de micoplasma MycoZapTM. Este reactivo combina agentes antibióticos y antimetabólicos para eliminar la contaminación por Mycoplasma detectable en tan solo cuatro días. Lo hemos optimizado para eliminar la contaminación por micoplasma con efectos mínimos en sus cultivos celulares.
¿Cómo se puede prevenir la contaminación por micoplasma?
Aunque nunca tendrá una garantía del 100 % de que sus experimentos están libres de Mycoplasma, puede implementar buenas prácticas de trabajo para limitar las posibilidades de contaminación y, al mismo tiempo, reducir el riesgo de propagar la contaminación a otros cultivos. La contaminación, la transmisión y la prevención de Mycoplasma requieren un enfoque triple para asegurarse de que está trabajando de la manera más limpia posible (9):
1. Use los reactivos y equipos de cultivo celular correctos
Es esencial que sus instalaciones ofrezcan el equipo adecuado y que el laboratorio se mantenga limpio y ordenado. Esto incluye tener una cabina de seguridad biológica de flujo laminar certificada, realizar inspecciones periódicas y limpiar las incubadoras, y garantizar la eliminación adecuada de consumibles y materiales de cultivo celular.
2. Revise y optimice sus procedimientos de cultivo celular
Use métodos confiables de detección de Mycoplasma y analice cultivos de forma regular para ayudar a limitar el impacto que los contaminantes tienen en sus instalaciones, así como en su trabajo. Mantenga los cultivos entrantes en cuarentena hasta que se demuestre que están libres de Mycoplasma y deseche inmediatamente los cultivos contaminados (si es posible). Compre cultivos de proveedores acreditados. Aunque no se recomienda el uso excesivo de antibióticos, para cultivos de células preciosas, el uso continuo de antibióticos que son efectivos contra especies de Mycoplasma, como los antibióticos MycoZapTM, puede ser una forma de prevenir la contaminación.
3. Asegúrese de adoptar técnicas asépticas
Lavarse y desinfectarse bien las manos es clave para trabajar de la manera más limpia posible. Use equipo de protección personal (PPE), como una bata de laboratorio limpia y guantes apropiados. Otras tácticas esenciales incluyen evitar pipetear con la boca, restringir las conversaciones en el banco a solo conversaciones esenciales, limpiar cualquier derrame de inmediato, usar pipetas para mover cualquier líquido (en lugar de verterlo) y manipular solo una línea celular a la vez.
1) Olarerin-George AO, Hogenesch JB (2015). Nucleic Acids Research 43(5): 2535–2542
2) Drexler HG, Uphof CC (2002). In Vitro Cell. Dev. Biol. – Animal 38:79–85
3) Rottem et al. (2012). Book chapter 3, book: Biomedical Tissue Culture, ISBN 978–953–51–0788–0
4) Drexler HG, Uphof CC (2002). Cytotechnology 39: 75–90
5) Drexler HG, Uphof CC (2002). Cytotechnology 39: 75–902) Boslett et al. (2014). BioMed Research International, article ID 5321053) Young et al. (2010). Nature Protocols 5:5
6) Boslett et al. (2014). BioMed Research International, article ID 532105
7) Young et al. (2010). Nature Protocols 5:5
8) Rottem et al. (2012). Book chapter 3, book: Biomedical Tissue Culture, ISBN 978–953–51–0788–0
9) Uphoff et al. (2002). Leukemia 16: 284–288