ПРИЛОЖЕНИЕ I

Определяне на съдържанието на скорбяла и на продуктите от нейното разлагане, включително глюкозата

1.   ПРЕДМЕТ И ОБЛАСТ НА ПРИЛОЖЕНИЕ

а)	Методът позволява да се определи тегловното съдържание на скорбялата и на продуктите, получени при разграждането ѝ, включително глюкозата, наричана по-долу „скорбяла“.

б)	Съдържанието на „скорбяла“, посочено в буква а), е равно на стойността Е, така както тя е изчислена в точка 6, буква a) на настоящото приложение.

2.   ПРИНЦИП

Пробата се разлага посредством натриев хидроокис и „скорбялата“ се разделя на глюкозни единици с амилоглюкозидаза. Определянето на глюкозата се извършва по ензимен начин.

3.   РЕАКТИВИ

(да се използва двойно дестилирана вода.)

3.1.   Разтвор на натриев хидроокис 0,5 N (0,5 mol/l).

3.2.   Ледена оцетна киселина (минимум) 96 %.

3.3.   Разтвор на амилоглюкозидаза:

непосредствено преди използване се разтварят около 10 mg амилоглюкозидаза (ЕС 3.2.1.3) (60 U/mg) в 1 ml вода (1).

3.4.   Буферен разтвор на триетаноламин:

разтварят се 14,0 g триетаноламин хидрохлорид [амониев три(2-хидроксиетил) хлорид] и 0,25 g магнезиев сулфат (MgSO47H2O) в 80 ml вода, към това се добавят 5 ml разтвор на натриев хидроокис 5 N (5 mol/l) и pH се наглася на 7,6 посредством разтвор на натриев хидроокис 1 N (1 mol/l).

Добавя се вода, за да се получи 100 ml разтвор. Този буферен разтвор се запазва минимум четири седмици при 4 °C.

3.5.   Разтвор на НАДФ (никотинамид-аденин-динуклеотидфосфат, динатриева сол):

Разтварят се 60 mg НАДФ в 6 ml вода. Този разтвор се запазва минимум 4 седмици при 4 °C.

3.6.   Разтвор на АТФ (аденозин-5-трифосфат, динатриева сол):

Разтварят се 300 mg АТФ. 3H2O и 300 mg натриев хидрогенкарбонат (NaHCO3) в 6 ml вода. Този разтвор се запазва минимум 4 седмици при температура 4 °C.

3.7.   Суспензия на HK/G6P-DH (Хексокиназа (ЕС 2.7.1.1) и на глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа (ЕС 1.1.1.49)):

Приготвя се суспензия от 280 U HK и 140 U от G6P-DH в 1 ml разтвор на амониев сулфат (С = 3,2 mol/l). Тази суспензия се запазва минимум една година при температура 4 °C.

4.   УРЕДИ

4.1.   Магнитен смесител с водна баня на 60 °C.

4.2.   Магнитни разбъркващи пръчки.

4.3.   Спектрофотометър U.V. с вани 1 сm.

4.4.   Пипети за ензимния анализ.

5.   МЕТОД

5.1.   Дезагрегиране с натриев хидроокис и ензимната хидролиза на „скорбялата“:

5.1.1.

Според предполагаемото съдържание на „скорбяла“, се избират претеглянията, които следват по-долу (съдържанието на „скорбяла“ не трябва да надвишава 0,4 g на претегляне): Предполагаемо съдържание на „скорбяла“ в g/100 Приблизително претеглено количество в g (р) Обем на мерителната колба в ml Коефициент на разреждане до 1 l (f) > 70 0,35—0,4 500 2 20—70 max. 0,5 500 2 5—20 max. 1 250 4 < 5 max. 2 200 5

5.1.2.

Пробата се претегля (с точност до 0,1 mg).

5.1.3.

Добавят се 50 ml от разтвора на натриевия хидроокис 0,5 N (точка 3.1) и се държи като се разбърква непрекъснато на водна баня магнитният смесител (точка 4.1) при температура 60 °C.

5.1.4.

PH се наглася на 4,6—4,8 с няколко капки концентрирана оцетна киселина (точка 3.2).

5.1.5.

Поставя се на водна баня с магнитния смесител (точка 4.1.) при температура 60 °C, добавя се 1,0 ml ензимов разтвор (точка 3.3) и се оставя да действа за тридесет минути, с разбъркване.

5.1.6.

След като изстине се прелива количествено в посочената мерителна колба (точка 5.1.1) и се добавя вода до белега.

5.1.7.

Ако е необходимо се филтрира през нагънат филтър (вж. забележката в № 1).

5.2.   Количествено определяне на глюкозата

5.2.1.

Експерименталният разтвор трябва да съдържа 100—1 000 mg глюкоза на литър, което съответства на ΔЕ340, което е между 0,1 и 1,0. Разреденият с вода експериментален разтвор в съотношение 1 + 30 не трябва да има екстинкция над 0,4 (измерена спрямо въздуха) при 340 nm.

5.2.2.

Буферният разтвор (точка 3.4) трябва да стигне стайна температура (20 °C).

5.2.3.

Температурата на реактивите и на пробата трябва да е между 20 °C и 25 °C.

5.2.4.

Измерва се екстинкцията при 340 nm спрямо въздуха (няма вана при референтнатата оптична траектория).

5.2.5.

Изпълнение според долната схема на вземане от течностите: Въвеждане във ваните Контрола (ml) Проба (ml) Буферен разтвор (реактив 3.4) 1,00 1,00 НАДФ (реактив 3.5) 0,10 0,10 АТФ (реактив 3.6) 0,10 0,10 Опитен разтвор (5.1.6 или 5.1.7) — 0,10 Дестилирана вода 2,00 1,90 Смесва се и след около 3 минути се измерва екстинкцията на разтворите (Е1). Реакцията се отключва чрез добавяне на: HK/G6P-DH (реактив 3.7) 0,02 0,02 Смесва се, изчаква се реакцията да приключи (около 15 минути) и се измерва екстинкцията на разтворите (Е2). Ако реакцията не е приключила до 15 минути, продължава се отчитането на екстинкцията на петминутни интервали, докато се получи константно увеличаване на екстинкцията. След това екстинкцията се екстраполира към времето на прибавяне на суспензията посочена в точка 3.7 (вж. забележка 2).

5.2.6.

За контролите и пробата се изчислява разликата в екстинкцията (Е2 — Е1). Разликата в екстинкцията на контролата (ΔЕконтрола) се изважда от тази на пробата (= ΔЕ): ΔЕ = ΔЕ опит – ΔЕ контрола От тази разлика може да се получи съдържанието на глюкоза на опитния разтвор: Съдържание на глюкоза в g/l на опитния разтвор Gl = ((3,22 × 180,16)/(6,3 × 1 × 0,1 × 1 000)) × ΔΕ340 = 0,921 × ΔΕ340 (3,22 = обема на разтвора за измерване; 1 = оптичен път на елемента; 0,1 = обема на разтвора на пробата; 180,16 = молекулната маса на глюкозата).

5.2.7.

Ако по някаква причина е невъзможно измерване на екстинкцията при 340 nm, измерването може да се извърши с дължина на вълната от 365 nm или 334 nm. В такъв случай числото 6,3 от горната формула за Gl следва да се замести с числото 3,5 или респективно 6,18.

6.   ИЗЧИСЛЯВАНЕ И ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

а)	Съдържание на „скорбяла“ Е в g/100 g: E = ((100 × 0,9 × Gl)/(p × f))

б)	Съдържание на „глюкоза“ Z в g/100 g: Z = ((100 × Gl)/(p × f))

където:

Gl	=	глюкоза, в g/l (5.2.6);
f	=	коефициент на разреждане (5.1.1);
p	=	претеглено количество от пробата, в g;
0,9	=	коефициент за превръщане на глюкозата в скорбяла.

Забележки:

1.	В случай че разтворът не може да бъде филтриран съгласно точка 5.1.7, химикът следва да вземе съответните мерки, за да се получи чист разтвор.

2.	В случай че се констатира инхибиране на ензими, препоръчва се прилагане на метода на „дозираните добавки“, като се използва чиста скорбяла.

---

(1)  U е международна единица за ензимна активност.

ПРИЛОЖЕНИЕ II

Определяне съдържанието на скорбяла или нишесте, декстрини или други изменени скорбяли или нишестета, съдържащи се в стоките по кодове по КН от 3505 20 10 до 3505 20 90, както и в скорбелените вещества, съдържащи се в стоките по кодове по КН от 3809 10 10 до 3809 10 90

I.   ПРИНЦИП

Чрез кисела хидролиза скорбялата се трансформира в захари редуктори, които се дозират обемно с фелингов разтвор.

II.   УРЕДИ И РЕАКТИВИ

1.	Колба от около 250 ml;

2.	Пикнометър от 200 ml;

3.	Градуирана бюрета от 25 ml;

4.	Солна киселина с плътност 1,19;

5.	Разтвор на калиева основа;

6.	Обезцветяващ въглен;

7.	Фелингов разтвор;

8.	1 % разтвор на метиленово синьо.

III.   НАЧИН НА РАБОТА:

В колба от около 250 ml се вкарва опитна проба, съответстваща на количество скорбяла около 1 g. Добавят се 100 ml дестилирана вода и 2 ml солна киселина. Нагрява се до кипене на обратен хладник в продължение на 3 часа.

Съдържанието на колбата, както и продуктът от изплакването ѝ, се прелива в пикнометъра от 200 ml и се добавя разтвора на калиевата основа до получаване на леко кисела реакция. Допълва се обема до 200 ml с дестилирана вода и всичко това се филтрира с малко обезцветяващ въглен.

След това разтворът се сипва в градуирана бюрета и се редуцират 10 ml фелингов разтвор по следния метод:

В колба с плоско дъно от около 250 ml се сипват 10 ml фелингов разтвор (5 ml от разтвор А и 5 ml от разтвор Б). Разклаща се до получаване на бистър разтвор, след което се добавят 40 ml дестилирана вода, както и малко количество кварц или пемза.

Колбата се поставя на квадратна азбестова плака с кръгъл отвор в средата с диаметър около 6 сm, която е поставена върху метална мрежа. Колбата се загрява, така че течността да кипне след около две минути.

Към кипящата течност се добавят с помощта на бюрета последователно количества от захарния разтвор докато синият цвят на фелинговия разтвор стане едва доловим, след което се добавят като индикатор 2 или 3 капки от разтвора от метиленово синьо, след това се допълва титруването, като се прибавя капка по капка ново количество от захарния разтвор до изчезване на синия цвят на индикатора.

За по-голяма точност титруването се повтаря при същите условия, като обаче се добавя наведнъж почти цялото количество захарен разтвор, необходим за редукцията на фелинговия разтвор. При това второ титруване редукцията на фелинговия разтвор следва да се направи за 3 минути. Кипенето трябва да продължи точно две минути. Титрува се, като на третата минута се прибавя капка по капка, докато изчезне синият цвят на индикатора.

Тегловният процент на скорбялата от пробата се определя по следната формула:

Скорбяла % = ((T × 200 × 100)/(n × p)) × 0,95

в която:

T	:	е количеството безводна декстроза в грамове, която съответства на 10 ml фелингов разтвор (5 ml от разтвор А и 5 ml от разтвор Б). Този титър съответства на 0,04945 g безводна декстроза, когато разтвор А съдържа 17,636 g мед на литър;
n	:	е числото на ml от захарния разтвор, използван за титруването;
p	:	представлява теглото на взетата проба;
0,95	:	е теглото на опитната проба;

IV.   ПРИГОТВЯНЕ НА ФЕЛИНГОВ РАЗТВОР

Разтвор А	:	В пикнометър се разтваря с дестилирана вода 69,278 g чист кристализирал меден сулфат за анализ (CuSO4 5H2O) без желязо и към разтвора се добавя дестилирана вода, за да се получи обем от 1 l. Точният титър на този разтвор трябва да се определи чрез количествено определяне на медта.
Разтвор Б	:	В пикнометър се разтваря в дестилирана вода 100 g натриев хидроокис и 346 g двоен тартарат натриево-калиев тартарат (сол на Рошел) и към разтвора се добавя дестилирана вода, за да се получи обем от 1 l.

Смесват се равни обеми от двата разтвора А и Б непосредствено преди използването им. 10 ml фелингов разтвор (5 ml от разтвор А и 5 ml от разтвор Б) се редуцират напълно, ако се действа в условията, посочени в III, с 0,04945 g безводна декстроза.

ПРИЛОЖЕНИЕ III

Откриване на брашно от мека пшеница в макаронени изделия

(по метода на Йънг и Джилс, модифициран от Бернартс и Грунер)

I.   ПРИНЦИП

Като се ползва неполярен разтворител, се приготвя екстракт от пробата от макароненото изделие за анализ.

Този екстракт се хроматографира върху тънък слой от силикагел, така че да се отделят стеролите, присъстващи в различните ивици на фракции.

Според броя на ярко оцветените ивици е възможно да се определи дали проверяваният продукт е произведен изключително от твърда пшеница или от мека пшеница, или от смес между двете. Възможно е също така да се определи дали са били добавяни и яйца.

II.   АПАРАТУРА И РЕАГЕНТИ

1.	Хомогенизатор или мелачка, за да се получи мливо, което да премине през стандартно сито с отвори 0,200 mm.

2.	Стандартно сито с отвори 0,200 mm.

3.	Изпарител с водна баня за изпаряване под намалено налягане.

4.

Стъклена плоча, алуминиев лист или друга подходяща основа с размери 20 сm на 20 сm, покрити с тънък слой от силикагел. Ако тънкият слой трябва да бъде приготвен, силикагелът се смесва с 13 % свързващо вещество, след което се полага на слой от 0,25 mm с подходяща апаратура, в съответствие с инструкциите на производителя.

5.	Микропипета за измерване на 20 микролитра.

6.	Контейнер с капак, подходящ за развиването на хроматограми.

7.	Пулверизатор.

8.	Петролеев етер с точка на кипене между 40 и 60 °C, редестилиран преди ползване.

9.	Безводен, етилов етер за анализ.

10.	Тетрахлор метан за хроматография, редестилиран преди ползване.

11.	Фосфомолибденова киселина за анализ.

12.	94° етилов алкохол.

III.   МЕТОД

Смилат се около 20 g от пробата за анализ, така че тя цялата да премине през ситото. Пробата са поставя в Ерленмайерова колба и колбата се покрива със 150 ml петролеев етер. Оставя се нормална температура до следващия ден. Разклаща се от време на време.

След това се филтрира през Бюхнерова фуния, снабдена с филтър или през керамичен филтър. Постепенно се прехвърля така полученият чист разтвор в 100 ml мерителна колба. Изпарява се разтворителят при намалено налягане като се нагрее колбата на водна баня 40 °C до 50 °C. Когато разтворителят се изпари, нагряването продължава при намалено налягане за още десет минути.

Когато колбата се охлади, екстрактът се претегля. Разрежда се с етилов етер на базата на 1 ml етилов етер за 60 mg екстракт.

Активират се тънките слоеве, като се нагреят до 130 °C в продължение на три часа. След това се охлаждат в ексикатор, съдържащ силикагел. Плаките, които не се използват, незабавно могат да бъдат запазени в същия ексикатор.

Полагат се капка по капка 20 микролитра от чистия разтвор, за да се оформи ивица с постоянна широчина и дължина от 3 cm върху слой, който за предпочитане трябва да е току-що активиран. Оставя се разтворителят да се изпари.

Развива се хроматограмата при нормална температура с тетрахлорметан, като се използва вана за хроматография, стените на която са покрити с филтърна хартия, напоена с разтворителя. След около час разтворителят ще достигне височина от около 18 cm. Изважда се плаката и се оставя разтворителят да се изпари на открито. За по-добро разделение на ивиците хроматограмата се развива втори път. Отново се оставя разтворителят да се изпари на открито.

Напръсква се тънкият слой от силикагел с разтвор от 20 % фосфомолибденова киселина в етилов алкохол. Цветът на слоя трябва да е равномерно жълт. Проявяват се ивиците като се нагрее напръсканата плака на 110 °C за пет минути.

IV.   ТЪЛКУВАНЕ НА ХРОМАТОГРАМАТА

Ако хроматограмата показва една единствена, ярко оцветена ивица с Rf от 0,4 до 0,5, пшеницата използвана за производството на въпросните макаронени изделия е твърда. Ако, от друга страна, се появят две ивици с еднаква яркост, то тогава използваният суров материал е мека пшеница. Смеси между двата вида пшеници могат да бъдат оценени чрез сравнение на различната яркост на двете ивици.

Ако се появят три ивици (две ивици на височината, където се намират основните ивици за мека пшеница, плюс още една ивица между тях), това означава, че към макароненото изделие са добавени и яйца. В този случай основният използван материал е твърда пшеница, ако средната ивица е по-ярка от горната. От друга страна, ако горната ивица е по-светла от средната, то тогава използваният суров материал е мека пшеница.

ПРИЛОЖЕНИЕ IV

Отмененият регламент и неговото изменение

Регламент (ЕИО) № 4154/87 на Комисията	(ОВ L 392, 31.12.1987 г., стр. 19)
Регламент (ЕО) № 203/98 на Комисията	(ОВ L 21, 28.1.1998 г., стр. 6)

ПРИЛОЖЕНИЕ V

Таблица на съответствието

Регламент (ЕИО) № 4154/87	Настоящият регламент
Членове 1—4	Членове 1—4
Член 5	—
—	Член 5
Член 6	Член 6
Приложения I, II и III	Приложения I, II и III
—	Приложение IV
—	Приложение V