BILAG

Vejledende noter til supplering af bilag II, del B, til direktiv 90/219/EØF

INDLEDNING

En given type GMM kan kun optages i bilag II, del C, når både de generelle og specifikke kriterier i bilag II, del B, er opfyldt.

Alle GMM'er, der er optaget i bilag II, del C, vil blive offentliggjort i Den Europæiske Unions Tidende, sammen med en beskrivelse af deres kendetegn eller referencekilder. Ved undersøgelsen af, om en type GMM kan optages i bilag II, del C, skal der tages hensyn til alle de bestanddele og i givet fald den proces, der er anvendt til at konstruere GMM'en. Det skal bemærkes, at selv om samtlige aspekter skal tages i betragtning, er det kun egenskaberne ved den endelige GMM, som vil blive vurderet på grundlag af kriterierne i bilag II, del B. Hvis alle bestanddelene af en given GMM undersøges hver for sig og vurderes som sikre, er det sandsynligt, at GMM'en vil opfylde sikkerhedskriterierne. Dette bør imidlertid ikke anses for givet og skal undersøges nøje.

Fremstilles der GMM'er som mellemstadier i produktionen af en endelig GMM, bør også disse mellemstadier vurderes på grundlag af kriterierne i bilag II, del B, for at hver enkelt type kan undtages fra direktivet, hvorved undtagelse af hele den indesluttede anvendelse reelt kan accepteres. Medlemsstaterne bør sikre, at de nedenstående retningslinjer anvendes, dels af brugerne som hjælp til at opfylde de nævnte kriterier, når de udarbejder ansøgningsmateriale til dokumentation for, at typer af GMM’er, der skal optages i bilag II, del C, er sikre for menneskers sundhed og miljøet, dels af de nationale kompetente myndigheder, når de vurderer, om kriterierne er opfyldt.

Ansøgningerne bør indeholde detaljerede og dokumenterede oplysninger, ud fra hvilke medlemsstaterne kan vurdere, om erklæringerne vedrørende GMM’ernes sikkerhed opfylder kriterierne. I tilfælde af videnskabelig usikkerhed bør der anvendes en forsigtig tilgang, og kun hvis der foreligger overbevisende dokumentation for, at kriterierne er opfyldt, vil der blive taget stilling til, om de pågældende GMM’er kan undtages fra direktivet.

Den nationale kompetente myndighed, der modtager en sådan ansøgning, bør, når den har sikret sig, at kriterierne er opfyldt, videresende den til Kommissionen, som bør høre det i direktivets artikel 21 omhandlede udvalg om, hvorvidt den pågældende GMM bør optages i direktivets bilag II, del C. Tillæg 1 til nærværende retningslinjer indeholder definitioner på de anvendte termer.

1.   GENERELLE KRITERIER

1.1.   Verifikation/autentifikation af stammen

Stammens identitet bør være kendt og verificeret, og vektorens/insertets struktur og funktion i den endelige GMM bør være velkarakteriseret. Detaljerede oplysninger om stammens historie (herunder de genetiske modifikationer) er nyttige for risikovurderingen. Det taksonomiske forhold til kendte, nært beslægtede skadelige mikroorganismer bør kendes, da dette kan give oplysninger om mulige skadelige egenskaber, der normalt ikke udtrykkes, men som vil kunne udtrykkes som følge af den genetiske modifikation. Eukaryote celle- og vævsdyrkningssystemers identitet verificeres i overensstemmelse med internationale klassifikationer (f.eks. ATCC).

Relevant litteratur (f.eks. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, videnskabelige afhandlinger og tidsskrifter, oplysninger fra virksomheder, der leverer DNA) bør gennemgås for oplysninger om historie og om sikkerhed, taksonomi, fænotype- og genmarkører. Der kan også indhentes nyttige oplysninger fra kultursamlinger og organisationer for kultursamlinger, som f.eks. World Federation of Culture Collections (WFCC), som udgiver World Directory of Collections of Cultures of Micro-organisms, og European Culture Collections Organisation (ECCO). Store europæiske kultursamlinger, som opbevarer omfattende grupper af mikroorganismer, bør også tages i betragtning. For nye isolater eller stammer, som ikke er undersøgt til bunds, bør eventuelle ubesvarede spørgsmål behandles i forbindelse med de test, der gennemføres for at bekræfte GMM'ens identitet. Denne situation kan opstå, hvis GMM-stammen adskiller sig markant fra den eller de parentale stammer, f.eks. hvis GMM'en er dannet ved cellefusion eller ved gentagne genetiske modifikationer.

Test, der skønnes nødvendige for at bekræfte stammens identitet, kan omfatte morfologi, farvning, elektronmikroskopi, serologi, ernæringsprofiler baseret på udnyttelse og/eller nedbrydning, iso-enzymanalyse, protein- og fedtsyreprofiler, GC-koncentration, DNA/RNA-fingeraftryk, amplifikation af taxon-specifikke DNA/RNA-sekvenser, gen-probing, hybridisering med rRNA-specifikke DNA-prober og DNA/RNA-sekventering. Resultaterne af sådanne test skal dokumenteres.

De bedste vilkår for identifikation af generne i GMM’en foreligger, hvis vektorens og insertets fuldstændige nukleotidsekvens kendes. Herved kan funktionen af hver enkelt genetisk enhed forklares. Vektor og insert bør så vidt muligt kun omfatte de genetiske sekvenser, som er nødvendige for at opnå den tilsigtede funktion. Dette mindsker sandsynligheden for, at skjulte funktioner indføres og udtrykkes, eller at der overføres uønskede træk.

1.2.   Dokumenteret bevis for sikkerhed

Der bør forelægges dokumenteret bevis for sikker brug af GMM’en. F.eks. resultater fra tidligere udførte test, oplysninger fra litteratursøgning eller dokumenterede erfaringer med organismens sikkerhed. Det skal bemærkes, at langvarig sikker anvendelse ikke nødvendigvis er bevis for sikkerhed, navnlig ikke, hvis GMM'en har været anvendt under stærkt kontrollerede betingelser af hensyn til sikkerheden.

Dokumenteret bevis for recipientstammens eller den parentale stammes sikkerhed vil være en afgørende faktor ved vurderingen af, om en GMM opfylder sikkerhedskriteriet. GMM'en kan imidlertid afvige betydeligt fra den eller de parentale organismer i henseender, som kan have betydning for sikkerheden, og sådanne afvigelser skal undersøges. Der bør udvises særlig forsigtighed, hvis formålet med den genetiske modifikation var at fjerne et skadeligt eller patogent træk fra recipientstammen eller den parentale stamme. For at godtgøre sikkerheden bør der i sådanne tilfælde forelægges dokumenteret bevis for, at skadelige eller potentielt skadelige træk faktisk er fjernet. Hvis der ikke foreligger data om den pågældende recipientstamme eller parentale stamme, kan data om den pågældende art anvendes. Ledsaget af en litteraturoversigt og taksonomiske undersøgelser af stammevariationen inden for den pågældende art kan disse data anvendes som bevis for sikkerheden ved den pågældende recipientstamme eller parentale stamme.

Er der ikke adgang til oplysninger, som kan bevise sikkerheden ved GMM'en, skal der udføres test med henblik herpå.

1.3.   Genetisk stabilitet

Den genetiske modifikation må ikke øge GMM'ens stabilitet i miljøet i forhold til den ikke-modificerede mikroorganisme, hvis dette kan have negative konsekvenser.

Hvis manglende stabilitet ved den genetiske modifikation kan mindske sikkerheden, skal der forelægges bevis for stabilitet. Dette gælder navnlig i tilfælde, hvor der er indført en inaktiverende mutation i GMM'en med henblik på at reducere skadelige egenskaber.

2.   SPECIFIKKE KRITERIER

2.1.   Ikke-patogen

GMM'en må ikke kunne fremkalde sygdom hos eller skade sunde mennesker, dyr eller planter under normale betingelser eller som følge af med rimelighed forudselige hændelser, såsom nålestik, utilsigtet indtagelse, udsætning for aerosol og udslip, hvorved miljøet udsættes for organismen. Er der øget sandsynlighed for, at personer med nedsat immunforsvar udsættes for GMM’en, f.eks. hvis GMM’en skal anvendes i klinisk sammenhæng, bør de mulige virkninger af denne udsætning tages i betragtning ved den samlede vurdering af sikkerheden ved den pågældende GMM.

Litteraturundersøgelser og baggrundsoplysninger, der er indsamlet med henblik på de generelle kriterier, kan formodes at indeholde mange af de oplysninger, der kræves her. Historiske data om håndtering af og sikkerheden ved den pågældende art og nært beslægtede stammer bør undersøges. Også lister over menneske-, dyre- og plantepatogener bør undersøges.

Eukaryote virale vektorer kan kun optages i bilag II, del C, hvis de ikke medfører skadelige virkninger på menneskers sundhed og miljøet. Deres oprindelse bør kendes såvel som mekanismen for deres svækkelse og de pågældende egenskabers stabilitet. Er det praktisk muligt, bør tilstedeværelsen af sådanne egenskaber ved virusset bekræftes før og efter modifikationen. Bruges sådanne vektorer, bør der kun anvendes deletionsmutationer. Konstruktioner, hvor der anvendes DNA- eller RNA-vektorer fra virus i dyrkede celler brugt som værter, kan også komme på tale, forudsat at ingen smitsomme virus er involveret heri eller kan dannes.

Det kan anses for usandsynligt, at ikke-virulente stammer af kendte patogene arter, såsom levende humane og animalske vacciner, vil fremkalde sygdom, og de opfylder således kriterierne for optagelse i bilag II, del C, forudsat:

1)	at den ikke-virulente stamme erfaringsmæssigt er sikker, uden negative virkninger for menneskers, dyrs eller planters sundhed (litteraturoversigt), eller

2)

at stammen stabilt mangler genmateriale, der determinerer virulens, eller har stabile mutationer, der vides at reducere virulens tilstrækkeligt (patogenicitetstest, genetiske undersøgelser — genprober, fag- og plasmid-detektion, restriktionsenzym-kortlægning, sekventering, proteinprober), og for hvilke der foreligger fyldestgørende bevis for sikkerhed. Risikoen for reversion af gendeletion eller mutation som følge af ny genoverførsel bør tages i betragtning.

Hvis de krævede oplysninger ikke fremgår af litteraturundersøgelser og taksonomiske undersøgelser, bør der udføres patogenicitetstest af den pågældende mikroorganisme. Disses test bør udføres på GMM'en; i visse tilfælde kan test af recipientstammen/den parentale stamme dog være tilstrækkelige. Hvis GMM'en imidlertid afviger stærkt fra den eller de parentale organismer, er det vigtigt at undgå falske konklusioner med hensyn til fravær af patogenicitet.

Eksempler på recipientstammer eller parentale stammer af mikroorganismer, som kan bruges til fremstilling af GMM'er, der vil kunne tages i betragtning med henblik på optagelse i bilag II, del C:

—

Tilstrækkeligt svækkede derivater af bakteriestammer, f.eks. Escherichia coli K12 og Staphylococcus aureus 83254, hvis vækst og overlevelse afhænger af tilførsel af næringsstoffer, som ikke findes hos mennesker eller i miljøet uden for kulturmedier (f.eks. behov for diaminopimelinsyre, thymin-auxotrofi).

—	Eukaryote celle- og vævsdyrkningssystemer (planter eller dyr, herunder pattedyr) kan anses for at være passende svækkede værter. GMM'er baseret på sådanne celler bør opfylde de andre her anførte kriterier (f.eks. ingen skadelige medfølgende agenser og ikke-mobiliserbare vektorer).

—

Stammer af ikke-patogene, naturligt forekommende værtsorganismer kan have ekstremt specialiserede økologiske nicher, hvilket medfører, at udslip i miljøet ville have minimal indvirkning på miljøet, eller de kan have en meget vid udbredelse uden skadelige virkninger, hvilket medfører, at udslip i miljøet ville have minimale virkninger på menneskers, dyrs og planters sundhed. Af eksempler på sådanne værtsorganismer kan nævnes mælkesyrebakterier, rhizobakterier, ekstremt termofile bakterier, antibiotikaproducerende bakterier eller svampe. De ovennævnte mikroorganismer skal være veldokumenterede i genetisk og molekylær henseende.

Vektor og insert i den form, de findes i den endelige GMM, bør ikke indeholde gener, der udtrykker et aktivt protein eller et transcript (f.eks. virulensdeterminanter, toksiner osv.) i en koncentration eller i en form, som giver GMM'en en fænotype, der vil kunne fremkalde sygdom hos mennesker, dyr og planter eller medføre negative virkninger i miljøet.

Det bør undgås at anvende vektor/insert, der indeholder sekvenser, som koder for skadelige træk i visse mikroorganismer, men som ikke giver GMM'en en fænotype, der vil kunne fremkalde sygdom hos mennesker, dyr og planter eller negative virkninger i miljøet. Der er også vigtigt, at det indsatte genmateriale ikke koder for en patogenicitetsdeterminant, som kan træde i stedet for en inaktiverende mutation i den parentale organisme.

Den fænotype, der hidrører fra en vektor, kan afhænge af recipientorganismen eller den parentale organisme. Det bør ikke uden videre antages, at resultater, der har gjort sig gældende for én værtsorganisme, gentager sig, når konstruktionen overføres til en anden værtsorganisme. F.eks. ville en inaktiveret retrovirusvektor i bakterier eller i de fleste cellelinjer ikke være i stand til at frembringe infektiøse viruspartikler. Den samme vektor i en pakke-celle-linje ville imidlertid frembringe infektiøse viruspartikler og ville, afhængigt af inaktiveringens art og insertets sekvenser, give GMM'en en fænotype, som vil kunne være sygdomsfremkaldende.

2.1.1.   Ikke-toksigen

GMM'en må ikke frembringe uventede toksiner eller øget toksigenicitet som følge af den genetiske modifikation. Af eksempler på mikrobielle toksiner kan nævnes exotoksiner, endotoksiner og mycotoksiner. Undersøgelser af recipientstammen eller den parentale stamme kan give nyttige oplysninger om dette aspekt.

I tilfælde, hvor recipientstammen eller den parentale stamme var toksinfri, skal man være opmærksom på muligheden for, at vektor/insert indfører toksiner eller stimulerer/neutraliserer hæmning af toksinproduktionen. Tilstedeværelsen af toksiner bør undersøges nøje, men det forhindrer ikke nødvendigvis, at den pågældende GMM kan optages i bilag II, del C.

2.1.2.   Ikke-allergen

Alle mikroorganismer er til en vis grad potentielt allergene, men nogle arter er kendte allergener, og disse er optaget i Rådets direktiv 93/88/EØF (1) og Kommissionens direktiv 95/30/EF (2) og senere ændringer. Det skal undersøges, om GMM'en tilhører denne kategori af allergene organismer. Som allergene bestanddele af mikroorganismer kan nævnes cellevægge, sporer, naturligt forekommende stofskifteprodukter (f.eks. proteolytiske enzymer) og visse antibiotika. Hvis vektor og insert udtrykkes i den resulterende GMM, må genproduktet ikke have biologiske aktiviteter, som vil kunne medføre vigtige allergener. Det skal bemærkes, at dette ikke kan anvendes som et absolut kriterium.

2.2.   Ingen medfølgende skadelige agenser

GMM'en må ikke indeholde kendte medfølgende agenser, såsom mycoplasma, vira, bakterier, svampe, andre plante/dyreceller og symbionter, som kan forvolde skade. Dette kan opnås ved i konstruktionen af GMM'en at anvende en recipientstamme eller en parental stamme, der vides at være fri for skadelige medfølgende agenser. Det må imidlertid ikke antages, at GMM'en vil være fri for medfølgende agenser, blot fordi dette var tilfældet for den eller de parentale organismer. Nye agenser kan være blevet indført i forbindelse med konstruktionen af GMM'en.

Der bør udvises særlig forsigtighed ved bestemmelsen af, om dyrecellekulturer indeholder potentielt skadelige medfølgende agenser, såsom lymfocytær choriomeningitis-virus eller mycoplasma, såsom Mycoplasma pneumoniae. Det kan være vanskeligt at detektere medfølgende agenser. Der bør tages hensyn til eventuelle begrænsninger i screening-effektiviteten.

2.3.   Overførsel af genetisk materiale

Det indsatte genmateriale i GMM'en bør ikke være overførbart eller mobiliserbart, hvis det kan være ophav til en skadelig fænotype i en recipientmikroorganisme.

Vektor og insert må ikke overføre resistensmarkører til GMM'en, såfremt resistens vil kunne vanskeliggøre sygdomsbehandling. Tilstedeværelsen af sådanne markører udelukker ikke automatisk, at GMM'en kan optages i bilag II, del C, men vil medføre, at der skal lægges større vægt på, at sådanne gener er ikke-mobiliserbare.

Hvis vektor er et virus, cosmid eller afledt af et virus, bør den også gøres ikke-lysogen, hvis den anvendes som kloningsvektor (f.eks. mangelfuld cI-lambda-repressor). Insertet må ikke være mobiliserbart som følge af tilstedeværelsen af f.eks. overførbare provirussekvenser eller andre funktionelle transposon-sekvenser.

Nogle vektorer, som integreres i værtskromosomet, kan også anses for at være ikke-mobiliserbare, men de bør undersøges fra sag til sag, navnlig med hensyn til mekanismer, som kan fremme kromosommobilitet (f.eks. tilstedeværelsen af en kromosomal kønsfaktor) eller transposition til andre replikoner, som kan være til stede i værtsorganismen.

2.4.   Sikkerhed for miljøet i tilfælde af udslip fra indeslutningen

Der vil normalt kun ske skade på miljøet, hvis en GMM er persistent og har farlige egenskaber. Ved vurderingen af skader på miljøet bør der tages hensyn til de forskellige miljøforhold, der gør sig gældende i medlemsstaterne, og ekstreme scenarier bør om nødvendigt tages i betragtning. Foreligger der oplysninger om tidligere udsætninger (tilsigtede eller ej) og om eventuelle hermed forbundne virkninger på miljøet, bør disse også forelægges.

2.4.1.   Organismens overlevelse

Ved afgørelsen om, hvorvidt en GMM kan forventes at forårsage negative virkninger på miljøet eller fremkalde sygdom hos planter og dyr, skal det undersøges, om GMM'ens evne til at overleve i miljøet vil øges, forblive uændret eller mindskes som følge af de biologiske egenskaber ved GMM'en. Er GMM'erne biologisk svækkede for så vidt angår overlevelse i miljøet, vil de ikke kunne overleve i et længere tidsrum uden for indeslutningen, hvorfor sandsynligheden for samspil med miljøet er reduceret.

Ved undersøgelsen af mulige negative virkninger på miljøet bør der også tages hensyn til den videre skæbne for GMM'er, der utilsigtet ender i fødekæden.

2.4.2.   Spredning

For at en GMM kan etablere sig i miljøet, skal den kunne overleve spredning til en passende niche og kunne etablere sig deri. Spredningsmetode og sandsynligheden for overlevelse i forbindelse med spredningen skal undersøges. F.eks. overlever mange mikroorganismer, når de spredes i aerosoler og smådråber samt via insekter og orme.

2.4.3.   Organismens etablering i miljøet

Etablering i et givet miljø afhænger af arten af det miljø, som GMM'en udslipper til, og dens evne til at overleve overførslen til det nye miljø. Mulighederne for etablering i en passende niche afhænger af den levedygtige populations størrelse, nichens størrelse og hyppigheden af passende nicher for arten. Sandsynligheden herfor afhænger af den enkelte art. Derudover vil resistens eller følsomhed over for biotisk eller abiotisk stress have stor betydning for en GMM's etablering i miljøet. En GMM's persistens i miljøet i et længere tidsrum afhænger af dens evne til at overleve og tilpasse sig miljøvilkårene eller til at påbegynde konkurrencedygtig vækst. Den genetiske modifikation og integrationsstedet kan have indflydelse på disse faktorer. Der er tilfælde, hvor den genetiske modifikation ikke kan ventes at frembringe denne virkning, f.eks.

—	når genproduktet bidrager til dannelsen af en sekundær metabolit ved vækstens afslutning, kan det ikke fremme vækstinitiering.

2.4.4.   Overførsel af genetisk materiale

Der fremkommer stadig flere oplysninger om overførsel af genetisk materiale mellem mikroorganismer. Selv om GMM'en kun har meget begrænset overlevelsesevne, vil det være vigtigt at have klarhed over, i hvor høj grad det indsatte genetiske materiale kan overleve i miljøet eller overføres til andre organismer og forvolde skade. Man har således påvist, at overførsel af genetisk materiale kan finde sted under forsøgsbetingelser i jord (herunder rhizosfærer), dyretarme og vand, enten gennem konjugation, transduktion eller transformation.

Muligheden for overførsel af genmateriale fra GMM'er, med ringe sandsynlighed for vækst og begrænset overlevelsesevne, er meget ringe. Hvis GMM'en ikke indeholder selvtransmissible plasmider eller transducerende fager, er aktiv overførsel praktisk taget udelukket. Risikoen vil være meget lille, hvis vektor/insert er ikke-selvtransmisibel og vanskeligt mobiliserbar.

---

(1)  EFT L 268 af 29.10.1993, s. 71.

(2)  EFT L 155 af 6.7.1995, s. 41.