BILAG I

Bestemmelse af stivelsesindholdet og nedbrydningsprodukter, inkl. glucose

1.   FORMÅL OG ANVENDELSE

a)	Metoden tillader bestemmelse af stivelsesindholdet og nedbrydningsprodukter, inkl. glucose, herefter benævnt »stivelse«.

b)	»Stivelsesindholdet« nævnt i litra a) er defineret som værdien E og beregnes som beskrevet i punkt 6, litra a), i dette bilag.

2.   PRINCIP

Prøven oplukkes ved hjælp af natriumhydroxid, og »stivelsen« spaltes i glucoseenheder med amyloglucosidase. Glucosen bestemmes enzymatisk.

3.   REAGENSER

(Brug dobbeltdestilleret vand).

3.1.   0,5 N (0,5 mol/l) natriumhydroxidopløsning.

3.2.   96 % (min.) iseddikesyre.

3.3.   Amyloglucosidaseopløsning:

Umiddelbart før brug opløses ca. 10 mg amyloglucosidase (EC 3.2.1.3) (60 U pr. mg) i 1 ml vand (1).

3.4.   Triethanolaminbufferopløsning:

14,0 g triethanolaminchlorhydrat (tris(2-hydroxyethyl)ammoniumchlorid) og 0,25 g magnesiumsulfat (MgSO47H2O) opløses i 80 ml vand. Der tilsættes ca. 5 ml 5 N (5 mol/l) natriumhydroxidopløsning, og indstilles til pH 7,6 ved hjælp af 1 N (1 mol/l) natriumhydroxidopløsning.

Der fyldes op til 100 ml med (dobbeltdestilleret) vand. Denne bufferopløsning holder sig i mindst fire uger ved 4 °C.

3.5.   Opløsning af NADP (Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat, dinatriumsalt):

60 mg NADP opløses i 6 ml vand. Denne opløsning er holdbar i mindst fire uger ved 4 °C.

3.6.   Opløsning af ATP (Adenosin-5′-triphosphat, dinatriumsalt):

300 mg ATP, 3H2O og 300 mg natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) opløses i 6 ml vand. Denne opløsning er holdbar i mindst fire uger ved 4 °C.

3.7.   Suspension af HK/G6P-DH (Hexokinase-EC 2.7.1.1) og glucose-6-phosphatdehydrogenase (EC 1.1.1.49):

280 U HK og 140 U G6P-DH suspenderes i 1 ml 3,2 M ammoniumsulfatopløsning. Denne suspension er holdbar i mindst et år ved 4 °C.

4.   APPARATUR

4.1.   Magnetomrører med vandbad (60 °C).

4.2.   Magnetstave.

4.3.   UV-spektrofotometer med 1 cm kuvetter.

4.4.   Pipetter til enzymatisk analyse.

5.   METODE

5.1.   Prøven oplukkes ved hjælp af natriumhydroxid, og »stivelsen« underkastes enzymatisk hydrolyse:

5.1.1.

De afvejede prøvemængder vælges efter det formodede indhold af »stivelse« som anført i nedenstående tabel (»stivelsesindholdet« i hver afvejet mængde må ikke overstige 0,4 g): Produktets formodede »stivelsesindhold« i g/100 g Omtrentlig afvejet prøvemængde i g (p) Målekolbens volumen i ml Fortyndingsfaktor op til hel liter (f) > 70 0,35-0,4 500 2 20-70 max. 0,5 500 2 5-20 max. 1 250 4 < 5 max. 2 200 5

5.1.2.

Prøven afvejes med en nøjagtighed på 0,1 mg.

5.1.3.

Tilsættes 50 ml 0,5 N natriumhydroxidopløsning (punkt 3.1), hvorefter der omrøres konstant i 30 min. med magnetomrøreren i vandbad ved 60 °C (punkt 4.1).

5.1.4.

Der indstilles til pH 4,6-4,8 med nogle få ml koncentreret iseddikesyre (punkt 3.2).

5.1.5.

Anbringes i vandbadet med magnetomrøreren (punkt 4.1) ved 60 °C. Der tilsættes 1,0 ml enzymopløsning (punkt 3.3), hvorefter man lader blandingen reagere i 30 min. under konstant omrøring.

5.1.6.

Efter afkøling overføres indholdet kvantitativt til en målekolbe (punkt 5.1.1), som fyldes op til mærket med vand.

5.1.7.

Om nødvendigt filtreres gennem et foldefilter (se bemærkning 1).

5.2.   Kvantitativ bestemmelse af glucose:

5.2.1.

Prøveopløsningen skal indeholde 100-1 000 mg glucose pr. liter, hvilket svarer til en ΔΕ340-værdi på 0,1-1,0. Når 1 del prøveopløsning fortyndes med 30 dele vand, må prøveopløsningens absorbans ikke overstige 0,4 (målt mod luft) ved 340 nm.

5.2.2.

Bufferopløsningen (punkt 3.4) indstilles til stuetemperatur (20 °C).

5.2.3.

Reagensernes og prøvens temperatur skal ligge mellem 20 °C og 25 °C.

5.2.4.

Absorbansen måles ved 340 nm i forhold til luft (ingen kuvette i referencestrålen).

5.2.5.

Gå frem efter nedenstående afpipetteringsskema: Kuvetterne påfyldes Blindprøve (ml) Måleprøve (ml) Buffer (reagens 3.4) 1,00 1,00 NADP (reagens 3.5) 0,10 0,10 ATP (reagens 3.6) 0,10 0,10 Prøveopløsning (5.1.6 eller 5.1.7) — 0,10 Dobbeltdestilleret vand 2,00 1,90 Væskerne blandes. Efter ca. 3 min. måles opløsningernes absorbans (E1). Reaktionen påbegyndes ved tilsætning af: HK/G6P-DH (reagens 3.7) 0,02 0,02 Væskerne blandes, reaktionens afslutning afventes (ca. 15 min.), og opløsningernes absorbans (E2) måles. Vær opmærksom på eventuelle afledningsreaktioner. Hvis reaktionen ikke er løbet til ende efter 15 min., måles absorbansen med 5 minutters intervaller, til stigningen er konstant. Så ekstrapoleres der baglæns til tidspunktet for tilsætning af den i punkt 3.7 nævnte suspension (se bemærkning 2).

5.2.6.

Absorbansforskellen (E2 – E1) udregnes for blindprøven og måleprøven. Blindprøvens absorbansforskel (ΔΕblind) fratrækkes måleprøven (ΔΕprøve): ΔΕ = ΔΕprøve – ΔΕblind Denne forskel giver glucoseindholdet Gl i prøveopløsningen, i g/l: Glucoseindhold i prøveopløsningen g/l Gl = ((3,22 × 180,16)/(6,3 × 1 × 0,1 × 1 000))× ΔΕ340 = 0,921 × ΔΕ340 (3,22 = volumen måleopløsning; 1 = celletykkelse; 0,1 = volumen mønsteropløsning; 180,16 = molvægten af glucose).

5.2.7.

Hvis det ikke er muligt at måle ved 340 nm, kan man måle ved 365 nm eller 334 nm, blot man erstatter tallet 6,3 i formlen for Gl med henholdsvis 3,5 og 6.18.

6.   BEREGNING OG ANGIVELSE AF RESULTATET

a)	»Stivelsesindhold« i g/100 g: E = ((100 × 0,9 × Gl)/(p × f))

b)	»Glucoseindhold« i g/100 g: Z = ((100 × Gl)/(p × f))

hvor:

Gl	=	glucose i g/l (5.2.6)
f	=	fortyndingsfaktor (5.1.1)
p	=	afvejet mængde prøve i g
0,9	=	omregningsfaktor fra glucose til stivelse.

Bemærkninger

1.	Såfremt det konstateres, at opløsningen ikke kan filtreres som angivet i punkt 5.1.7, træffer kemikeren de nødvendige foranstaltninger.

2.	Såfremt der konstateres en hæmning af enzymerne, tilrådes det at anvende metoden »doserede tilsættelser« med anvendelse af ren stivelse.

---

(1)  Hvor U er den internationale enhed for enzymaktivitet.

BILAG II

Bestemmelse af indholdet af stivelse, dextrin eller anden modificeret stivelse indeholdt i varerne henhørende under KN-kode 3505 20 10 til 3505 20 90 samt af stivelse og stivelsesprodukter indeholdt i varerne henhørende under KN-kode 3809 10 10 til 3809 10 90

I.   METODENS PRINCIP

Ved syrehydrolyse sønderdeles stivelsen til reducerende sukker, der bestemmes volumetrisk ved hjælp af Fehling-væske.

II.   APPARATER OG REAGENSER

1.	Kolbe med et rumindhold på ca. 250 ml

2.	Målekolbe med et rumindhold på 200 ml

3.	Burette med et rumindhold på 25 ml

4.	Saltsyre, vægtfylde 1,19

5.	Kaliumhydroxid i vandig opløsning

6.	Aktivt kul

7.	Fehling-væske

8.	Metylenblåt i 1 pct. vandig opløsning.

III.   FORSØGETS GENNEMFØRELSE

I en kolbe rummende ca. 250 ml indvejes så meget mængde prøve, at det svarer til ca. 1 g stivelse, og der tilføjes 100 ml destilleret vand og 2 ml saltsyre. Blandingen koges i tre timer under tilbagesvaling.

Efter afkøling hældes kolbens indhold kvantitativt på en målekolbe rummende 200 ml, og der tilføjes så meget kaliumhydroxid, at opløsningen kun reagerer svagt surt. Derefter fyldes der op med destilleret vand indtil 200 ml, og væsken filtreres gennem aktivt kul for at blive affarvet.

Med denne opløsning fyldes derefter en gradueret burette, og 10 ml Fehling-væske reduceres på følgende måde:

I en stålkolbe rummende ca. 250 ml hældes 10 ml Fehling-væske (5 ml væske A og 5 ml væske B). Kolben rystes, indtil der fremkommer en klar opløsning, og derpå tilføjes 40 ml destilleret vand og lidt kvarts eller pimpsten.

Kolben anbringes på en kvadratisk plade af asbest, der i midten har en cirkelformet åbning med diameter ca. 6 cm. Asbestpladen lægges på et trådnet. Kolben opvarmes nu således, at væsken begynder at koge i løbet af ca. 2 minutter.

Den kogende væske tilsættes derefter så meget af sukkeropløsningen fra buretten, at Fehling-væskens blå farve næsten ikke er synlig. Der tilsættes nu 2-3 dråber metylenblåtopløsning som indikator, og titreringen fortsættes ved yderligere dråbevis tilsætning af sukkeropløsningen, indtil indikatorens blå farve forsvinder.

Med henblik på større nøjagtighed gentages titreringen under samme betingelser, idet dog næsten hele den mængde sukkeropløsning, der kræves til reducering af Fehling-væsken, tilsættes på én gang. Ved denne titrering skal Fehling-væsken være fuldstændig reduceret i løbet af 3 minutter. Fortsæt kogningen i nøjagtig to minutter. Titreringen fortsættes ved yderligere dråbevis tilsætning i det tredje minut, indtil indikatorens blå farve forsvinder.

Prøvens indhold af stivelse i vægtprocent beregnes efter følgende formel:

Stivelse i procent = ((T × 200 × 100)/(n × p)) × 0,95

hvor:

T	=	et kvantum vandfri dextrose i g, der svarer til 10 ml Fehling-væske, 10 ml Fehling-væske (5 ml væske A og 5 ml væske B) svarer til 0,04945 g vandfri dextrose, når væske A indeholder 17,636 g kobber pr. liter
n	=	den ved titreringen forbrugte mængde sukkeropløsning i ml
p	=	den indvejede mængde prøve
0,95	=	faktor til omregning af vandfri dextrose til stivelse.

IV.   FREMSTILLING AF FEHLING-VÆSKE

Væske A	:	I en målekolbe opløses 69,278 g krystalliseret, analyserent, jernfrit kobbersulfat (CuSO4 5H2O) i destilleret vand til 1 liter. Opløsningens nøjagtige indhold af kobber kontrolleres ved en kvantitativ bestemmelse af dette.
Væske B	:	I en målekolbe opløses 100 g natriumhydroxid og 346 g kaliumnatriumtartrat (Seignettesalt) i destilleret vand til 1 liter.

De to væsker A og B blandes i lige dele umiddelbart før anvendelsen. 10 ml Fehling-væske (5 ml væske A og 5 ml væske B) reduceres fuldstændigt af 0,04945 g vandfri dextrose, når fremgangsmåden er som beskrevet under III.

BILAG III

Påvisning af mel eller gryn af blød hvede i makaroni, spaghetti og lignende varer

(efter Young og Gilles-metoden, ændret af Bernaerts og Grunner)

I.   METODENS PRINCIP

Af prøven udvindes med anvendelse af et ikke-polart opløsningsmiddel en ekstrakt.

Ekstrakten kromatograferes på en plade med et tyndt lag af kiselgel. Herved skilles de tilsvarende steroler i forskellige fraktioner af form som striber.

Ud fra antallet af de intensive farvestriber kan man slutte, om produktet kun er fremstillet af hård hvede eller blød hvede eller af en blanding af hård og blød hvede. Endvidere kan det konstateres, om der er anvendt æg til produktets fremstilling.

II.   APPARATER OG REAGENSER

1.	Homogenisator eller laboratoriemølle for at kunne fremstille et malet produkt, der kan passere gennem en sigte med maskevidde 0,200 mm.

2.	Standardiseret sigte med en maskevidde af 0,200 mm.

3.	Vakuum-inddampningsapparat med vandbad.

4.

Glasplade, aluminiumfolie eller andre egnede materialer i format 20 × 20 cm påført et tyndt lag kiselgel. Påfører man selv det tynde lag af kiselgel, anvendes en blanding af kiselgel og gips med et indhold af gips på ca. 13 %. Det påføres med et egnet redskab, idet producentens vejledning følges. Det skal være 0,25 mm tykt.

5.	Mikropipette til afmåling af 20 mikroliter.

6.	Kar med låg til fremkaldelse af kromatogrammerne.

7.	Forstøver.

8.	Petroleumsæter med et kogeinterval mellem 40 og 60 °C, redestilleret før brugen.

9.	Diethylæter, vandfri, til analyse.

10.	Carbontetrachlorid, til kromatografi, redestilleret før brugen.

11.	Molybdenphosphorsyre, til analyse.

12.	Ethylalkohol, 94 volumenprocent.

III.   FORSØGETS GENNEMFØRELSE

Ca. 20 g af prøven males så fint, at stoffet kan passere helt gennem sigten. Den fint formalede prøve hældes på en Erlenmeyer-kolbe, dækkes med 150 ml petroleumsæter og står til næste dag ved stuetemperatur. Kolben rystes fra tid til anden.

Derefter filtreres blandingen gennem en Büchner-tragt med filtrerlag eller gennem et foldefilter. Det klare filtrat overføres portionsvis til en 100 ml-kolbe, og opløsningsmidlet fordampes under reduceret tryk ved en vandbadstemperatur på 40-50 °C. Efter opløsningsmidlets fordampning fortsættes opvarmningen i endnu 10 minutter under reduceret tryk.

Efter kolbens afkøling bestemmes vægten af den opnåede ekstrakt. Ekstrakten opløses derefter i diethylæter, idet der for hver 60 mg ekstrakt benyttes 1 ml diethylæter.

Tyndtlagspladerne med kiselgel aktiveres ved opvarmning ved 130 °C i tre timer. Man lader dem afkøle i en ekssikkator over kiselgel. Plader, der ikke straks anvendes, forbliver i ekssikkatoren.

På et så frisk aktiveret lag som muligt påføres 20 mikroliter af den klare opløsning i form af en jævn stribe på 3 cm’s længde, bestående af ved siden af hinanden liggende dråber, hvorpå man lader opløsningsmidlet fordampe.

Kromatogrammet elueres ved stuetemperatur med carbontetrachlorid i et kromatografikar, hvis vægge er dækket med filtrerpapir, der indeholder opløsningsmidlet. Efter ca. en times forløb har opløsningsmidlet nået en højde af 18 cm. Man tager pladen op og lader opløsningsmidlet fordampe i luften. Kromatogrammet elueres derefter en gang til, for at striberne skal blive bedre skilt fra hinanden. Opløsningsmidlet lader man igen fordampe i luften.

Tyndtlagskromatogrammet påsprøjtes nu med en 20 %-opløsning af molybdenphosphorsyre i ethylalkohol. Lagets farve skal være ensartet gul. Ved en derpå følgende 5 minutter lang opvarmning til 110 °C gøres striberne synlige.

IV.   AFLÆSNING AF KROMATOGRAMMET

Viser kromatogrammet en eneste kraftig hovedstribe med en Rf-værdi af ca. 0,4 til 0,5, er der ved produktets fremstilling anvendt hård hvede. Er der derimod to hovedstriber af samme intensitet, er det anvendte råstof blød hvede. Blandinger af blød og hård hvede kan erkendes ved at de to striber har forskellig intensitet.

Kan der på kromatogrammet konstateres tre striber (to striber i højde som blød hvedes hovedstriber og en stribe, der ligger derimellem), tyder dette på, at produktet indeholder æg. Er den øverste stribe i dette tilfælde svagere end den mellemliggende stribe, er der anvendt hård hvede som råstof. Er den øverste stribe derimod mere udtalt end den mellemliggende stribe, er der anvendt blød hvede.

BILAG IV

Ophævet forordning med ændring

Kommissionens forordning (EØF) nr. 4154/87	(EFT L 392 af 31.12.1987, s. 19)
Kommissionens forordning (EF) nr. 203/98	(EFT L 21 af 28.1.1998, s. 6)

BILAG V

Sammenligningstabel

Forordning (EØF) nr. 4154/87	Nærværende forordning
Artikel 1 til 4	Artikel 1 til 4
Artikel 5	—
—	Artikel 5
Artikel 6	Artikel 6
Bilag I, II og III	Bilag I, II og III
—	Bilag IV
—	Bilag V