I LISA

Tärklisesisalduse ja selle glükoosi sisaldavate lagunemisproduktide kindlaksmääramine

1.   EESMÄRK JA RAKENDUSALA

a)	Meetodi abil saab kindlaks määrata tärklisesisalduse ja selle glükoosi sisaldavad lagunemisproduktid, edaspidi „tärklis”.

b)	Punktis a osutatud tärklise sisaldus on võrdne käesoleva lisa punkti 6 alapunkti a kohaselt arvutatud väärtusega E.

2.   PÕHIMÕTE

Proov lagundatakse naatriumhüdroksiidiga ja „tärklis” jagatakse amüloglükoosidaasiga glükoosiühikuteks. Glükoos määratakse ensüümselt.

3.   REAKTIIVID

(Kasutatakse bidestilleeritud vett).

3.1.   0,5 N naatriumhüdroksiidi lahus (0,5 mol/l).

3.2.   (Vähemalt) 96 %line jää-äädikhappes.

3.3.   Amüloglükoosidaasi lahus:

Vahetult enne kasutamist lahustatakse umbes 10 mg amüloglükoosidaasi (EC 3.2.1.3) (60 U/mg) 1 ml vees. (1)

3.4.   Trietanoolamiini puhverlahus:

Lahustatakse 14,0 g trietanoolamiinhüdrokloriidi [tris(2-hüdroksüetüül)ammooniumkloriid] ja 0,25 g magneesiumsulfaati (MgSO47H2O) 80 ml vees, lisatakse umbes 5 ml 5 N naatriumhüdroksiidi lahust (5 mol/l) ning viiakse pH tase 1 N (1 mol/l) natriumhüdroksiidi lahusega 7,6-le.

Täiendatakse veega kuni 100 ml lahuse saamiseni. Puhverlahus säilib vähemalt neli nädalat temperatuuril 4 °C.

3.5.   NADP (nikotiinamiidadeniindinukleotiidfosfaat, dinaatriumsool) lahus:

Lahustatakse 60 mg NADP-lahust 6 ml vees. Lahus säilib vähemalt neli nädalat temperatuuril 4 °C.

3.6.   ATP (adenosiin-5-trifosfaat, dinaatriumsool) lahus:

Lahustatakse 300 mg ATP. 3H2O ja 300 mg naatriumvesinikkarbonaati (NaHCO3) 6 ml vees. Lahus säilib vähemalt neli nädalat temperatuuril 4 °C.

3.7.   HK/G6P-DH (Heksokinaas-EC 2.7.1.1) ja glükoos-6-fosfaat-dehüdrogenaas (EC 1.1.1.49)-suspensioon:

heljundatakse 280 U HK ja 140 U G6P-DH 1 ml-s 3,2 M ammooniumsulfaadi lahuses. Suspensioon säilib vähemalt üks aasta temperatuuril 4 °C.

4.   SEADMED

4.1.   Magnetsegur-veevann temperatuuril 60 °C.

4.2.   Magnetvardad.

4.3.   1 cm optilise küvetiga UV-spektrofotomeeter.

4.4.   Ensüümianalüüsi pipetid.

5.   MEETOD

5.1.   Proovi lagundamine naatriumhüdroksiidiga ja „tärklise” ensüümihüdrolüüs

5.1.1.

Valitakse proovi mass vastavalt eeldatavale tärklisesisaldusele (tärklisesisaldus ei tohi olla üle 0,4 g proovi kohta) järgmiselt: Toote eeldatav tärklisesisaldus g/100 g Proovi ligikaudne mass grammides (p) Mõõtekolvi maht ml Lahjendusaste ühe liitrini (f) > 70 0,35–0,4 500 2 20–70 kuni 0,5 500 2 5–20 kuni 1 250 4 < 5 kuni 2 200 5

5.1.2.

Kaalutakse proovi täpsusega 0,1 mg.

5.1.3.

Lisatakse 50 ml 0,5 N naatriumhüdroksiidi lahust (punkt 3.1) ja segatakse pidevalt 30 minutit veevannis (punkt 4.1) magnetseguriga temperatuuril 60 °C.

5.1.4.

Lisatakse mõni ml kontsentreeritud äädikhapet (punkt 3.2) ning viiakse pH tase vahemikku 4,6–4,8.

5.1.5.

Asetatakse magnetseguriga veevanni (punkt 4.1) temperatuuril 60 °C, lisatakse 1,0 ml ensüümilahust (punkt 3.3) ja lastakse reageerida 30 minutit, samal ajal pidevalt segades.

5.1.6.

Pärast jahutamist mõõdetakse kogus mõõtekolbi (punkt 5.1.1) ning täidetakse veega märgini.

5.1.7.

Vajaduse korral filtreeritakse läbi kurdfiltri (vt märkus 1).

5.2.   Glükoosi koguse määramine

5.2.1.

Katselahuses peab olema 100–1 000 mg glükoosi liitri kohta, mis vastab ΔΕ340 väärtusele 0,1–1,0. Neelduvus katselahuses, mida on lahjendatud veega (suhtes 1 : 30), ei tohi olla üle 0,4 lainepikkusel (mõõdetuna õhu suhtes) 340 nm.

5.2.2.

Kuumutatakse puhverlahust (punkt 3.4) toatemperatuurini (20 °C).

5.2.3.

Reaktiivide ja proovi temperatuur peab olema 20–25 °C.

5.2.4.

Mõõdetakse neelduvust lainepikkusel 340 nm õhu suhtes (s.o võrdlusmeetodi puhul ilma optilise küvetita).

5.2.5.

Pipetitakse vastavalt järgmisele tabelile: Kallatakse optilisse küvetti Kontroll (ml) Katse (ml) Puhver (reaktiiv 3.4) 1,00 1,00 NADP (reaktiiv 3.5) 0,10 0,10 ATP (reaktiiv 3.6) 0,10 0,10 Katselahus (5.1.6 või 5.1.7) — 0,10 Bidestilleeritud vesi 2,00 1,90 Segatakse ja umbes kolme minuti pärast mõõdetakse neelduvust lahustes (E1). Reaktsiooni alustamiseks lisatakse: HK/G6P.DH (reaktiiv 3.7) 0,02 0,02 Segatakse, lastakse reageerida lõpuni (umbes 15 minutit) ja mõõdetakse neelduvust lahustes (E2). Jälgitakse reaktsiooni. Kui reaktsioon ei ole 15 minuti pärast lõppenud, jätkatakse neelduvuse lugemist viieminutiliste vaheaegade järel, kuni reaktsiooni kiirus on konstantne. Siis ekstrapoleeritakse tagasi suspensiooni vastavalt punktile 3.7 lisamise hetkeni (vt märkus 2).

5.2.6.

Arvutatakse neelduvuste erinevus (E2 – E1) nullreaktiivis ja proovis. Lahutatakse proovi neelduvusest (ΔΕ proov) nullreaktiivi neelduvus (ΔΕ nullreaktiiv): ΔΕ = ΔΕ proov – ΔΕ nullreaktiiv Saadud vahe annab katselahuse glükoosisisalduse. Katselahuse glükoosisisaldus, g/l Gl = ((3,22 × 180,16)/(6,3 × 1 × 0,1 × 1 000)) × ΔΕ340 = 0,921 × ΔΕ340 (3,22: mõõdetava lahuse maht; 1: küveti paksus; 0,1: proovilahuse maht; glükoosi molekulmass on 180,16 (g/mol).

5.2.7.

Kui mingil põhjusel ei ole võimalik mõõta lainepikkusel 340 nm, võib seda teha lainepikkusel 365 nm või 334 nm, kusjuures arv 6,3 eespool esitatud glükoosivalemis tuleb asendada vastavalt arvuga 3,5 või 6,18.

6.   ARVUTUSKÄIK JA TULEMUSTE ESITAMINE

a)	E = tärklisesisaldus väljendatuna g/100 g: E = ((100 × 0,9 × Gl)/(p × f))

b)	Z = glükoosisisaldus väljendatuna g/100 g: Z = ((100 × Gl)/(p × f))

kus:

Gl	=	glükoos väljendatuna g/l (5.2.6);
f	=	lahjendusaste (5.1.1);
p	=	proovi mass grammides;
0,9	=	glükoosi ümberarvestustegur tärkliseks.

Märkused

1.	Kui katselahust ei ole võimalik filtreerida punkti 5.1.7 kohaselt, tuleb selge lahuse saamiseks võtta vajalikke meetmeid.

2.	Kui esineb ensüümiinhibeerimine, soovitatakse kohaldada meetodit, mille käigus lisatakse kindlates kogustes puhast tärklist.

---

(1)  U on ensüümi aktiivsuse rahvusvaheline ühik.

II LISA

Kaupade CN-koodide 3505 20 10 – 3505 20 90 alla kuuluvate kaupade tärklise-, dekstriini- või muu modifitseeritud tärklise sisalduse ning CN-koodide 3809 10 10 – 3809 10 90 alla kuuluvate kaupade tärklisainete sisalduse määramine

I.   PÕHIMÕTE

Happelise hüdrolüüsi teel muundatakse tärklis redutseerivateks suhkruteks, mis määratakse mahu põhjal Fehlingi lahuse abil.

II.   SEADMED JA REAKTIIVID

1.	250 ml kolb;

2.	200 ml mõõtekolb;

3.	25 ml mõõtebürett;

4.	Soolhape tihedusega 1,19;

5.	Kaaliumhüdroksiidi lahus;

6.	Aktiivsüsi; värvitustamiseks;

7.	Fehlingi lahus;

8.	1 %line metüleensinise lahus.

III.   MEETOD

Umbes 1 g tärklist sisaldav proov pannakse 250 ml kolbi. Lisatakse 100 ml destilleeritud vett ja 2 ml soolhapet. Segu lastakse keema ja keedetakse kolm tundi.

Kolvi sisu ning loputusvesi kallatakse 200 ml mõõtekolbi. Jahutatakse ning tehakse peaaegu neutraalseks kaaliumhüdroksiidi lahusega. Täiendatakse destilleeritud veega 200 ml-ni ja filtreeritakse läbi vähese koguse aktiivsöe.

Seejärel valatakse lahus mõõtebüretti ja redutseeritakse 10 ml Fehlingi lahust järgmisel meetodil:

Umbes 250 ml lameda põhjaga kolbi kallatakse 10 ml Fehlingi lahust (5 ml lahust A ja 5 ml lahust B). Loksutatakse, kuni lahus on selge, ja lisatakse 40 ml destilleeritud vett ning väike kogus kvartsi või pimsskivi.

Kolb asetatakse neljakandilisele asbestalusele, mille keskel on umbes 6 cm läbimõõduga ümmargune auk, mis omakorda on traatvõrgu peal. Kolbi kuumutatakse nii, et vedelik hakkaks umbes kahe minuti pärast keema.

Büretist lisatakse keevale vedelikule vähehaaval suhkrulahust, kuni Fehlingi lahuse sinine värv on vaevu märgatav; seejärel lisatakse indikaatoriks 2–3 tilka metüleensinise lahust ja tiitritakse lõpuni, lisades tilkhaaval edasi suhkrulahust, kuni indikaatori sinine värv on kadunud.

Suurema täpsuse saamiseks korratakse tiitrimist samades tingimustes, kuid peaaegu kogu suhkrulahus, mis on vajalik Fehlingi lahuse redutseerimiseks, lisatakse korraga. Teist korda tiitrides peab Fehlingi lahus redutseeruma kolme minuti jooksul. Keedetakse veel täpselt kaks minutit, lisades keevale lahusele ühe minuti jooksul tilkhaaval reaktiivi, kuni sinine värv on kadunud.

Tärklise massiprotsent proovis määratakse järgmise valemiga:

tärklise massiprotsent = ((T × 200 × 100)/(n × p)) × 0,95

kus:

T	:	10 ml Fehlingi lahusele (5 ml lahust A ja 5 ml lahust B) vastava veevaba dekstroosi kogus grammides. Kõnealune tiiter vastab 0,04945 g veevabale dekstroosile, kui lahus A sisaldab 17,636 g vaske liitri kohta;
n	:	tiitrimisel kasutatud suhkrulahuse kogus ml-tes;
p	:	proovi mass;
0,95	:	veevaba dekstroosi ümberarvestustegur tärkliseks.

IV.   FEHLINGI LAHUSTE VALMISTAMINE

Lahus A	:	Mõõtekolvis lahustatakse 69,278 g puhast rauavaba kristallilist vasksulfaati – analüütilist reaktiivi (CuSO4 5H2O) – destilleeritud vees ja täidetakse kolb destilleeritud veega 1 l-ni. Lahuse täpset tiitrit tuleb kontrollida vasekoguse määramisega.
Lahus B	:	Mõõtekolvis lahustatakse destilleeritud vees 100 g naatriumhüdroksiidi ja 346 g kaaliumnaatriumtartraati (Seignette’i sool) ja täidetakse kolb destilleeritud veega ühe liitrini.

Lahused A ja B tuleb segada võrdsetes kogustes vahetult enne kasutamist. 0,04945 g veevaba dekstroosi redutseerib täielikult 10 ml Fehlingi lahust (5 ml lahust A ja 5 ml lahust B) III punktis nimetatud tingimustel.

III LISA

Pehmest nisust valmistatud püüli- ja lihtjahu kindlaksmääramine makaronides, spagetis ja muudes samalaadsetes makarontoodetes

(Youngi ja Gilles’i meetodi kohaselt, mida on täiendanud Bernaerts ning Gruner)

I.   PÕHIMÕTE

Mittepolaarse lahusti abil valmistatakse analüüsitava makarontoote proovist ekstrakt.

Kõnealust ekstrakti analüüsitakse kromatograafiliselt õhukesel silikageelikihil, et eraldada erinevates ribakujulistes fraktsioonides leiduvad steroolid.

Vastavalt eredavärviliste ribade arvule on võimalik kindlaks määrata, kas uuritav toode on valmistatud ainult kõvast või pehmest nisust või nende kahe segust. Samuti on võimalik kindlaks määrata, kas on lisatud mune.

II.   SEADMED JA REAKTIIVID

1.	Homogenisaator või veski jahvatise saamiseks, mis läbib 0,200 mm avadega standardsõela.

2.	0,200 mm avadega standardsõel.

3.	Veevanniga aurusti vähendatud rõhu all aurustamiseks.

4.

Klaas-, alumiinium- või mõni muu õhukese silikageelikihiga kaetud alus mõõtmetega 20 × 20 cm. Kui kõnealune õhuke kiht tuleb valmistada, peab kasutama umbes 13 %lise kipskrohviga segatud silikageeli, mis kantakse peale selleks ettenähtud seadmega 0,25 mm paksuse kihina vastavalt tootja kasutusõpetusele.

5.	Mikropipett 20 mikroliitri mõõtmiseks.

6.	Kromatogrammi saamiseks sobiv kaanega anum.

7.

Pihusti.

8.	Petrooleeter keemispunktiga 40–60 °C, enne kasutamist redestilleeritud.

9.	Analüüsiks vajalik veevaba etüüleeter.

10.	Kromatograafiliseks analüüsiks vajalik süsiniktetrakloriid, enne kasutamist redestilleeritud.

11.	Analüüsiks vajalik fosfomolübdeenhape.

12.	94 %line etüülalkohol.

III.   MEETOD

Jahvatatakse umbes 20 g proovi nii peeneks, et see läbiks sõela täielikult. Proov pannakse Erlenmeyeri kolbi ja kaetakse 150 ml petrooleetriga. Jäetakse toatemperatuuril seisma kuni järgmise päevani. Loksutatakse aeg-ajalt.

Seejärel filtreeritakse läbi filtrikihiga varustatud Büchneri lehtri või paagutatud filtri. Sel viisil saadud selge lahus valatakse järk-järgult 100 ml mõõtekolbi. Lahustit aurutatakse vähendatud rõhu all, kuumutades kolbi veevannis temperatuuril 40–50 °C. Kui lahusti on aurustunud, kuumutatakse vähendatud rõhu all veel 10 minutit.

Kui kolb on jahtunud, määratakse ekstrakti mass. Lahjendatakse ekstrakti etüüleetriga vahekorras 1 ml etüüleetrit 60 mg ekstrakti kohta.

Aktiveeritakse õhukesed kihid, tõstes nende temperatuuri 130 °C-ni kolmeks tunniks. Lastakse jahtuda silikageeli sisaldavas eksikaatoris. Aluseid, mida kohe ei kasutata, võib hoida ka samas eksikaatoris.

Lisatakse tilkhaaval 20 mikroliitrit selget lahust, et soovitavalt uuesti aktiveeritud alusel moodustuks püsiva laiusega ja 3 cm pikkune riba. Lastakse lahustil auruda.

Voolutatakse süsiniktetrakloriidiga kromatograafiliselt toatemperatuuril anumas, mille seinad on kaetud lahustis niisutatud filterpaberiga. Umbes tunni aja pärast tõuseb lahusti 18 cm kõrgusele. Alus eemaldatakse ja lastakse lahustil lahtiselt auruda. Ribade paremaks eraldamiseks voolutatakse kromatogrammi teist korda. Lahustil lastakse uuesti lahtiselt auruda.

Pihustatakse õhuke kiht silikageeli koos etüülalkoholis oleva 20 %lise fosfomolübdeenhappe lahusega. Kiht peab olema ühtlaselt kollane. Alust viis minutit temperatuuril 110 °C kuumutades moodustuvad ribad.

IV.   KROMATOGRAMMI TÕLGENDAMINE

Kui kromatogrammil on näha üks eredavärvilist põhiriba, mille Rf on ligikaudu 0,4–0,5, on vastava makarontoote valmistamisel kasutatud kõva nisu. Kui aga ilmub kaks võrdse eredusega riba, on toormaterjalina kasutatud pehmet nisu. Kõva ja pehme nisu segusid on võimalik hinnata kahe riba suhtelise ereduse järgi.

Kui on näha kolm riba (kaks riba sellel kõrgusel, kus pehme nisu puhul esinevad põhiribad, ning üks riba nende keskel), on makarontootele lisatud mune. Kui keskmine riba on ülemisest eredam, on toorainena kasutatud kõva nisu. Kui ülemine riba on aga keskmisest eredam, on toorainena kasutatud pehmet nisu.

IV LISA

Kehtetuks tunnistatud määrus koos muudatusega

Komisjoni määrus (EMÜ) nr 4154/87	(EÜT L 392, 31.12.1987, lk 19).
Komisjoni määrus (EÜ) nr 203/98	(EÜT L 21, 28.1.1998, lk 6).

V LISA

Vastavustabel

Määrus (EMÜ) nr 4154/87	Käesolev määrus
Artiklid 1 kuni 4	Artiklid 1 kuni 4
Artikkel 5	—
—	Artikkel 5
Artikkel 6	Artikkel 6
I, II ja III lisa	I, II ja III lisa
—	IV lisa
—	V lisa