32003R0440

Regulamento (CE) n.o 440/2003 da Comissão

de 10 de Março de 2003

que altera o Regulamento (CEE) n.o 2676/90 que determina os métodos de análise comunitários aplicáveis no sector do vinho

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta o Regulamento (CE) n.o 1493/1999 do Conselho, de 17 de Maio de 1999, que estabelece a organização comum do mercado vitivinícola(1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 2585/2001(2), e, nomeadamente, o n.o 3, primeiro parágrafo, do seu artigo 46.o,

Considerando o seguinte:

(1) O Regulamento (CEE) n.o 2676/90 da Comissão(3), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 1622/2000(4), descreve, no seu anexo, diversos métodos de análise.

(2) Foi desenvolvido, e validado de acordo com critérios reconhecidos internacionalmente, um método de análise do ácido D-málico adequado à determinação de baixos teores de ácido D-málico em vinhos. A descrição do novo método em causa foi adoptada pela Organização Internacional da Vinha e do Vinho na sua Assembleia Geral de Junho de 2002.

(3) Foi desenvolvido, e validado de acordo com critérios reconhecidos internacionalmente, um novo método de análise da razão isotópica do carbono do etanol do vinho ou do etanol obtido por fermentação de mostos de uva, de mostos de uva concentrados e de mostos de uva concentrados rectificados. A descrição do novo método em causa foi adoptada pela Organização Internacional da Vinha e do Vinho na sua Assembleia Geral de 2001.

(4) A utilização dos referidos métodos de análise permite assegurar um melhor controlo da qualidade e da autenticidade dos vinhos, bem como evitar os litígios decorrentes da aplicação de métodos de controlo menos precisos, nomeadamente no que respeita ao enriquecimento com misturas de açúcares de proveniência diversa e ao controlo da acidificação dos vinhos com ácido málico.

(5) Importa completar o método em vigor para o doseamento do ácido D-málico descrito no anexo do Regulamento (CEE) n.o 2676/90 com a descrição do procedimento aplicável à determinação de baixos teores e aditar a descrição do novo método isotópico aplicável ao carbono do etanol.

(6) As medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité de Gestão do Vinho,

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1.o

O anexo do Regulamento (CEE) n.o 2676/90 é alterado do seguinte modo:

1. No capítulo 20 " Ácido D-málico", o ponto 8 é substituído pelo texto que consta do anexo I do presente regulamento.

2. É aditado um capítulo 45, cujo texto consta do anexo II do presente regulamento.

Artigo 2.o

O presente regulamento entra em vigor no sétimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros.

Feito em Bruxelas, em 10 de Março de 2003.

Pela Comissão

Franz Fischler

Membro da Comissão

(1) JO L 179 de 14.7.1999, p. 1.

(2) JO L 345 de 29.12.2001, p. 10.

(3) JO L 272 de 3.10.1990, p. 1.

(4) JO L 194 de 31.7.2000, p. 1.

ANEXO I

"8. DOSEAMENTO DE BAIXOS TEORES DE ÁCIDO D(+)-MÁLICO NO VINHO

8.1. Âmbito de aplicação

O método descrito é aplicável ao doseamento, por via enzimática, do ácido D-málico, em vinhos com teores do mesmo inferiores a 50 mg/l.

8.2. Princípio

O princípio do método é descrito no ponto 1. A formação de NADH, determinada pelo aumento da absorvância a 340 nm, é proporcional à quantidade de D-malato presente, após a introdução na célula de medida de uma quantidade de ácido D-málico equivalente a 50 mg/l.

8.3. Reagentes

Solução de ácido D-málico a 0,199 g/l, além dos reagentes indicados no ponto 2.

8.4. Equipamento

O equipamento a utilizar é descrito no ponto 3.

8.5. Preparação da amostra

A preparação da amostra é descrita no ponto 4.

8.6. Procedimento

O procedimento é descrito no ponto 5, introduzindo-se na célula de medida uma quantidade de ácido D-málico equivalente a 50 mg/l (0,025 ml de solução de ácido D-málico a 0,199 g/l em substituição do volume de água equivalente); os valores obtidos são reduzidos em 50 mg/l.

8.7. Validação interna

O quadro seguinte resume o processo de validação interna do método de doseamento do ácido D-málico após a adição de 50 mg/l deste isómero.

>POSIÇÃO NUMA TABELA>"

ANEXO II

"45. DETERMINAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE MASSA ISOTÓPICA DA RAZÃO ISOTÓPICA 13C/12C DO ETANOL DO VINHO OU DO ETANOL OBTIDO POR FERMENTAÇÃO DE MOSTOS DE UVAS, DE MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS OU DE MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS RECTIFICADOS

1. ÂMBITO DE APLICAÇÃO

O presente método permite determinar a razão isotópica 13C/12C do etanol do vinho e do etanol obtido por fermentação de produtos vitícolas (mosto de uvas, mosto de uvas concentrado, mosto de uvas concentrado rectificado).

2. REFERÊNCIAS NORMATIVAS

ISO: 5725:1994 'Fidelidade dos métodos de ensaio - Determinação da repetibilidade e da reprodutibilidade de um método de ensaio normalizado por recurso a ensaios interlaboratoriais.'

V-PDB: Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0,0112372).

Método 8 do anexo do presente regulamento: 'Detecção do enriquecimento dos mostos de uvas, mostos de uvas concentrados, mostos de uvas concentrados rectificados e de vinhos por aplicação da ressonância magnética nuclear do deutério (RMN-FINE)'

3. TERMOS E DEFINIÇÕES

13C/12C: Razão isotópica do carbono (13C e 12C) numa determinada amostra.

δ13C: Teor de carbono 13 (13C), expresso em permilagem ([permil ]).

RMN-FINE: Fraccionamento Isotópico Natural Específico, estudado por Ressonância Magnética Nuclear.

V-PDB: Vienna Pee Dee Belemnite. A PDB, referência primária para a determinação das variações naturais dos teores isotópicos de carbono 13, consiste num carbonato de cálcio proveniente de um rostro de belemnite do Cretácico da formação Pee-Dee da Carolina do Sul (Estados Unidos). A sua razão isotópica 13C/12C ou RPDB é RPDB = 0,0112372. A PDB encontra-se esgotada desde há muito, tendo, contudo, permanecido a referência primária para exprimir as variações naturais dos teores isotópicos de carbono 13 pela qual são calibrados os materiais de referência disponíveis na Agência Internacional da Energia Atómica (IAEA), em Viena (Áustria). Convencionalmente, as determinações isotópicas da abundância natural de carbono 13 são expressas em relação à V-PDB.

m/z: Relação massa/carga.

4. PRINCÍPIO

A assimilação do dióxido de carbono pelas plantas durante a fotossíntese realiza-se principalmente por duas vias metabólicas, designadamente o metabolismo C3(ciclo de Calvin) e o metabolismo C4 (Hatch e Slack). Estes dois mecanismos de fotossíntese apresentam um fraccionamento isotópico diverso. Deste modo, os produtos provenientes de plantas C4, tais como os açúcares e o álcool de fermentação, possuem teores de carbono 13 superiores aos seus homólogos provenientes de plantas C3. A maioria das plantas, nomeadamente a vinha e a beterraba, pertencem ao grupo C3. A cana-de-açúcar e o milho pertencem ao grupo C4. A determinação do teor de carbono 13 permite, pois, a detecção e a avaliação do açúcar de origem C4 (açúcar de cana ou isoglucose de milho) adicionado aos produtos da vinha (mostos de uva, vinho, etc.). A confrontação das informações de teor de carbono 13 com as informações obtidas por RMN-FINE permitem também quantificar a adição de misturas de açúcares ou álcoois provenientes de plantas C3 e C4.

O teor de carbono 13 é determinado no dióxido de carbono resultante da combustão completa da amostra. As abundâncias dos principais isotopómeros de massas 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 e 12C17O16O) e 46 (12C16O18O), decorrentes das diversas combinações possíveis dos isótopos 18O, 17O, 16O, 13C e 12C, são determinadas a partir das correntes iónicas medidas em três colectores diferentes de um espectrómetro de massa isotópica. As contribuições dos isotopómeros 13C17O16O e 12C17O2 podem ser desprezadas devido à sua fraca abundância. A corrente iónica correspondente a m/z = 45 é corrigida de forma a tomar em conta a contribuição do 12C17O16O, calculada em função da intensidade da corrente medida para m/z = 46 atendendo às abundâncias relativas de 18O e 17O (correcção de Craig). A comparação com uma referência calibrada pela referência internacional V-PDB permite o cálculo do teor de carbono 13 na escala relativa δ13C.

5. REAGENTES

Os materiais e consumíveis dependem dos instrumentos (6) utilizados pelo laboratório. Os sistemas geralmente utilizados baseiam-se num analisador elementar, que pode ser equipado para a introdução de amostras colocadas em cápsulas metálicas seladas ou para a injecção de amostras líquidas através de um septo, por recurso a uma seringa.

Em função do tipo de instrumentos utilizados, podem utilizar-se os seguintes materiais de referência, reagentes e consumíveis:

- materiais de referência:

- fornecidos pelo IAEA:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

- fornecidos pelo IMMR de Geel (B) (Instituto dos Materiais e Medidas de Referência):

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

- amostra-padrão de trabalho com uma relação 13C/12C conhecida, calibrada por materiais de referência internacionais.

- a lista indicativa de consumíveis infra é estabelecida para sistemas de fluxo contínuo:

- hélio de qualidade analítica (CAS 07440-59-7),

- oxigénio de qualidade analítica (CAS 07782-44-7),

- dióxido de carbono de qualidade analítica, utilizado como gás de referência secundário para o teor de carbono 13 (CAS 00124-38-9),

- reagente de oxidação para o forno do sistema de combustão - por exemplo, óxido de cobre (ΙΙ) para análise elementar (CAS 1317-38-0),

- exsicante destinado a eliminar a água produzida pela combustão - por exemplo, anidrona para análise elementar (perclorato de magnésio) (CAS 10034-81-8). (Não necessário no caso de aparelhos munidos de um sistema de eliminação crioscópica de água ou de um capilar de permeabilidade selectiva).

6. APARELHOS E UTENSÍLIOS

6.1. Espectrómetro de massa de razão isotópica

Espectrómetro de massa de razão isotópica que permita determinar o teor natural relativo de 13C do CO2 gasoso com uma precisão interna de 0,05 [permil ] ou mais, expressa em valor relativo (9). A precisão interna é definida como a diferença entre duas medições com a mesma amostra de CO2. O espectrómetro de massa destinado à medição das razões isotópicas encontra-se geralmente munido de um colector triplo com o objectivo de medir em simultâneo as intensidades correspondentes a m/z = 44, 45 e 46. O espectrómetro de massa de razão isotópica deve ser também munido de um sistema duplo de introdução da amostra, de forma a efectuar medições alternativas da amostra desconhecida e da amostra de referência, ou utilizar um sistema integrado que efectue a combustão quantitativa das amostras e separe o dióxido de carbono dos restantes produtos de combustão antes da determinação no espectrómetro de massa.

6.2. Dispositivo de combustão

Dispositivo de combustão que permita a conversão quantitativa de etanol em dióxido de carbono e a eliminação de todos os restantes produtos de combustão, incluindo a água, sem qualquer fraccionamento isotópico. O dispositivo pode consistir num sistema de fluxo contínuo integrado no espectrómetro de massa (6.2.1) ou num sistema de combustão autónomo (6.2.2). O dispositivo em causa deverá permitir obter uma precisão pelo menos equivalente à indicada em (11).

6.2.1. Sistemas de fluxo contínuo

Estes sistemas são constituídos por um analisador elementar ou por um cromatógrafo de gás munido de um sistema de combustão em linha.

No caso de sistemas equipados para a introdução das amostras contidas em cápsulas metálicas, utiliza-se o seguinte material de laboratório:

- microsseringa ou micropipeta volumétrica, com extremidade adequada,

- balança com aproximação mínima de 1 μg,

- encapsulador,

- cápsulas de estanho para amostras líquidas,

- cápsulas de estanho para amostras sólidas,

Nota:

Para limitar os riscos de evaporação das amostras de etanol, é possível colocar nas cápsulas um material absorvente (por exemplo, chromosorb W 45-60 mesh) desde que se verifique previamente, através de um ensaio em branco, que o mesmo não contém uma quantidade significativa de carbono que possa alterar as medições.

Em caso de utilização de um analisador elementar munido de um injector para líquidos ou de um sistema de preparação por cromatografia-combustão, utiliza-se o seguinte material de laboratório:

- seringa para líquidos,

- recipientes com sistema de vedação estanque e septos inertes.

Os materiais de laboratório indicados nas listas supra constituem exemplos e podem ser substituídos por outros materiais de desempenho equivalente, em função do dispositivo de combustão e do espectrómetro de massa utilizados pelo laboratório.

6.2.2. Sistemas autónomos de preparação

Neste caso, as amostras de dióxido de carbono resultantes da combustão das amostras em estudo e da amostra de referência são recolhidos em ampolas, que são posteriormente instaladas no sistema duplo de entrada do espectrómetro para proceder à análise isotópica. Podem utilizar-se diversos tipos de dispositivos de combustão descritos na literatura:

- sistema de combustão fechado com oxigénio gasoso em circulação,

- analisador elementar com fluxo de hélio e de oxigénio,

- ampola de vidro selada, com enchimento de óxido de cobre (ΙΙ) utilizado como agente de oxidação.

7. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS PARA ANÁLISE

O etanol deve ser extraído do vinho antes da determinação isotópica. A extracção é efectuada através da destilação do vinho descrita no ponto 3.1 do método n.o 8 (RMN-FINE).

No caso do mosto de uvas, do mosto de uvas concentrado e do mosto de uvas concentrado rectificado, os açúcares deverão primeiro ser fermentados, com formação de etanol, como descrito no ponto 3.2 do método n.o 8.

8. PROCEDIMENTO

Todas as etapas preparatórias devem ser efectuadas sem perdas significativas de etanol por evaporação, facto que alteraria a composição isotópica da amostra.

A descrição que se segue faz referência aos procedimentos geralmente utilizados para a combustão de amostras de etanol por intermédio de sistemas automatizados de combustão existentes nos circuitos comerciais. Podem utilizar-se outros métodos adequados de preparação do dióxido de carbono para análise isotópica que assegurem a conversão quantitativa da amostra de etanol em dióxido de carbono sem perdas por evaporação.

Procedimento experimental baseado na utilização de um analisador elementar:

a) Colocação das amostras nas cápsulas:

- utilizar cápsulas, um encapsulador e uma placa de preparação limpos,

- pegar numa cápsula de dimensão adequada, com o encapsulador,

- introduzir na cápsula o volume necessário de líquido, por recurso à micropipeta,

- nota:

são necessários 3,84 mg de etanol absoluto ou 4,17 mg de destilado com um título alcoólico de 92 % (m/m) para obter 2 mg de carbono. A quantidade adequada de destilado deve ser calculada da mesma forma, atendendo à quantidade de carbono necessária em função da sensibilidade do espectrómetro de massa,

- vedar as cápsulas por intermédio dos encapsuladores,

- cada cápsula deverá ser vedada de forma totalmente estanque. Caso contrário, deverá ser rejeitada, preparando-se uma nova cápsula,

- preparar duas cápsulas para cada amostra,

- colocar as cápsulas numa posição adequada, na placa do transportador automático de amostras do analisador elementar. Cada cápsula deve ser cuidadosamente identificada por um número de ordem,

- colocar sistematicamente no início e no final da série de amostras cápsulas com as referências de trabalho,

- inserir regularmente amostras de controlo na série de amostras;

b) Controlo e ajustamento do analisador elementar e do espectrómetro de massa:

- ajustar a temperatura dos fornos do analisador elementar e os caudais de hélio e oxigénio, tendo em vista uma combustão óptima da amostra.

- verificar a ausência de fugas no sistema de análise elementar e de espectrometria de massa (por exemplo, regulando a corrente iónica para m/z = 28, correspondente a N2.).

- ajustar o espectrómetro de massa para determinar as intensidades das correntes iónicas correspondentes a m/z = 44, 45 e 46.

- com o auxílio de amostras de controlo conhecidas, verificar o sistema antes de iniciar as medições com as amostras.

c) Realização de uma série de medições

As amostras colocadas no transportador automático de amostras do analisador elementar (ou do cromatógrafo) são introduzidas sucessivamente. O dióxido de carbono produzido pela combustão de cada amostra é eluído para o espectrómetro de massa, que mede as correntes iónicas. O computador acoplado aos instrumentos regista as intensidades das correntes iónicas e calcula os valores de δ respeitantes a cada amostra (9).

9. CÁLCULOS

O objectivo do método consiste em determinar a razão isotópica 13C/12Cdo etanol extraído do vinho ou de produtos da fermentação de uvas. A razão isotópica 13C/12Cpode ser expressa pelo seu desvio relativamente a uma referência de trabalho. O desvio isotópico do carbono 13 (δ 13C) é calculado, numa escala δ/1000, por comparação dos resultados obtidos para a amostra em estudo com os resultados obtidos para a referência de trabalho, previamente calibrada pela referência primária internacional (V-PDB). Os valores de δ 13C são expressos em relação à referência de trabalho de acordo com a fórmula:

δ13Cech/ref [permil ] = 1000 × (Rech-Rref)/Rref

em que Rech e Rref são, respectivamente, as razões isotópicas 13C/12C da amostra e do dióxido de carbono utilizado como gás de referência.

Os valores de δ 13C são expressos em relação à V-PDB de acordo com a fórmula:

δ13Cech/V-PDB [permil ] = δ13Cech/ref +δ13Cref/V-PDB + (δ13Cech/ref × δ13Cref/V-PDB)/1000,

em que δ13Cref/V-PDB é o desvio isotópico previamente determinado para a referência de trabalho em relação à V-PDB.

Durante a medição em linha, poderão observar-se pequenos desvios atribuíveis à variação das condições instrumentais. Neste caso, os valores de δ 13C das amostras devem ser corrigidos em função da diferença entre o valor de δ13C medido para a amostra-padrão de trabalho e o seu valor real, anteriormente calibrado pela V-PDB por comparação com um dos materiais de referência internacional.Pode presumir-se que, entre duas medições com a amostra-padrão de trabalho, o desvio e, consequentemente, a correcção a aplicar aos resultados obtidos para as amostras, são lineares. Deve efectuar-se uma medição com a amostra-padrão de trabalho no início e no final de cada série de amostras. Poderá assim calcular-se, por interpolação linear, a correcção aplicável a cada amostra.

10. CONTROLO E GARANTIA DA QUALIDADE

Verificar que o valor de 13C para a referência de trabalho não excede em mais de 0,5 [permil ] o valor admitido. No caso contrário, deverá verificar-se a regulação do espectrómetro e, eventualmente, reajustá-la.

Verificar, para cada amostra, que a diferença de resultado entre duas cápsulas medidas sucessivamente é inferior a 0,3 [permil ]. Nestas condições, o resultado final de uma determinada amostra é o valor médio das duas cápsulas. Se o desvio for superior a 0,3[permil ], deverá repetir-se a medição.

A verificação da realização correcta da medição poderá basear-se na intensidade da corrente iónica para m/z = 44, que é proporcional à quantidade de carbono injectado no analisador elementar. Nas condições-padrão, a intensidade da corrente iónica deve ser praticamente constante para todas as amostras em estudo. A observação de desvios significativos poderá decorrer da evaporação de etanol (por exemplo, uma cápsula mal vedada) ou de uma instabilidade do analisador elementar ou do espectrómetro de massa.

11. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO DO MÉTODO (PRECISÃO)

Foi realizada um primeiro estudo de colaboração interlaboratorial (11.1) com destilados de álcoois de origem vínica e de álcoois de cana e beterraba, bem como de diversas misturas das três origens. Uma vez que o estudo em causa não abrangeu a etapa de destilação, foram também utilizadas informações complementares provenientes de outros ensaios interlaboratoriais realizados com vinhos (11.2), nomeadamente testes interlaboratoriais de aptidão (11.3) para as medições isotópicas. Os resultados demonstram que os diversos sistemas de destilação utilizados em condições satisfatórias, nomeadamente os sistemas aplicáveis às medições RMN-FINE, não determinam uma variabilidade significativa para as determinações de δ13C do etanol do vinho. Os parâmetros de fiabilidade observados para os vinhos são praticamente idênticos aos obtidos no estudo de colaboração interlaboratorial (11.1) com destilados.

11.1. Estudo de colaboração interlaboratorial com destilados

Ano do ensaio interlaboratorial: 1996

Número de laboratórios: 20

Número de amostras: 6 amostras em duplicado em teste cego

Analito: δ 13C do etanol

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

11.2. Estudo interlaboratorial de dois vinhos e um álcool

Ano do ensaio interlaboratorial: 1996

Número de laboratórios: 14 no respeitante à destilação de vinhos, dos quais sete também para a determinação do δ 13C do etanol dos vinhos,

oito no respeitante à medição de δ 13C da amostra de álcool.

Número de amostras: três (vinho branco de TAV 9,3 %.; vinho branco de TAV 9,6 %; álcool de título alcoométrico 93 % m/m).

Analito: δ 13C do etanol

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

Os laboratórios participantes utilizaram diversos sistemas de destilação. As determinações isotópicas δ 13C realizadas num único laboratório ao conjunto dos destilados enviados pelos participantes não mostram nem valores anómalos nem valores significativamente distintos dos valores médios. A variância dos resultados (S2 = 0,0059) é comparável às variâncias de repetibilidade Sr2 do estudo de colaboração interlaboratorial com destilados (11.1).

11.3. Resultados dos testes interlaboratoriais de aptidão para as determinações isotópicas

Desde Dezembro de 1994, organizam-se regularmente estudos internacionais exercícios de aptidão para as determinações isotópicas em vinhos e álcoois (destilados com TAV = 96 %.). Os resultados permitem aos laboratórios participantes o controlo da qualidade das suas análises. A exploração estatística dos resultados permite avaliar a variabilidade das determinações em condições de reprodutibilidade e, consequentemente, estimar os parâmetros de variância e de limite de reprodutibilidade. Os resultados obtidos para as determinações de δ 13C do etanol dos vinhos e destilados são resumidos no quadro seguinte:

>POSIÇÃO NUMA TABELA>

N número de laboratórios participantes.

11.4. Limites de repetibilidade e de reprodutibilidade

Os dados dos diversos estudos interlaboratoriais apresentados nos quadros precedentes permitem estabelecer para o presente método, incluindo a etapa de destilação, os seguintes limites de repetibilidade e de reprodutibilidade:

Limite de repetibilidade r: 0,24

Limite de reprodutibilidade R: 0,6."