«I»

:

Teritoriu în interiorul căruia prezența ESB la bovinele indigene a fost evaluată ca foarte improbabilă, în scopul exportului în Comunitatea Europeană de animale certificate în conformitate cu modelele de certificate BOV-X și BOV-Y.

«II»

:

Teritoriu recunoscut oficial ca indemn de tuberculoză în scopul exportului în Comunitatea Europeană de animale certificate în conformitate cu modelul de certificat BOV-X.

«III»

:

Teritoriu recunoscut oficial ca indemn de bruceloză în scopul exportului în Comunitatea Europeană de animale certificate în conformitate cu modelul de certificat BOV-X.

«IVa»

:

Teritoriu recunoscut oficial ca indemn de leucoză enzootică bovină (LEB) în scopul exportului în Comunitatea Europeană de animale certificate în conformitate cu modelul de certificat BOV-X.

«IVb»

:

Teritoriu cu exploatații desemnate, recunoscut oficial ca indemn de leucoză enzootică bovină (LEB) în scopul exportului în Comunitatea Europeană de animale certificate în conformitate cu modelul de certificat BOV-X.

«V»

:

Teritoriu recunoscut oficial ca indemn de bruceloză în scopul exportului în Comunitatea Europeană de animale certificate în conformitate cu modelul de certificat OVI-X.

«VI»

:

Constrângeri geografice:

În cazul Bulgariei, cod de teritoriu BG-1, se pot importa animalele certificate în conformitate cu modelele de certificat sanitar-veterinar BOV-X, BOV-Y, RUM, OVI-X și OVI-Y doar în părțile teritoriului unui stat membru care sunt înscrise în anexa II la Decizia 2001/138/CE din 9 februarie 2001, în cazul în care statul membru respectiv permite acest lucru.

«VII»

:

Teritoriu recunoscut oficial ca indemn de tuberculoză în scopul exportului în Comunitatea Europeană de animale certificate în conformitate cu modelul de certificat RUM.

«VIII»

:

Teritoriu recunoscut oficial ca indemn de bruceloză în scopul exportului în Comunitatea Europeană de animale certificate în conformitate cu modelul de certificat RUM.

«IX»

:

Teritoriu recunoscut oficial ca indemn de boala Aujeszky în scopul exportului în Comunitatea Europeană de animale certificate în conformitate cu modelul de certificat POR-X.

«BOV-X»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru animale domestice din specia bovină (Bos taurus, Bison bison, Bubalus bubalisși hibrizii lor) destinate reproducerii și/sau producției după import

«BOV-Y»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru animale domestice din specia bovină (Bos taurus, Bison bison, Bubalus bubalisși hibrizii lor) destinate sacrificării imediate după import

«OVI-X»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru animale domestice din specia ovină (Ovis aries) și caprină (Capra hircus) destinate reproducerii și/sau producției după import

«OVI-Y»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru animale domestice din specia ovină (Ovis aries) și caprină (Capra hircus) destinate sacrificării imediate după import

«POR-X»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru animale domestice din specia porcină (Sus scrofa) destinate reproducerii și/sau producției după import

«POR-Y»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru animale domestice din specia porcină (Sus scrofa) destinate sacrificării imediate după import

«RUM»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru animale nedomestice, cu excepția suidelor

«SUI»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru suide nedomestice

«A»

:

Garanții referitoare la testele de depistare a bolii limbii albastre și a bolii hemoragice epizootice efectuate asupra unor animale certificate în conformitate cu modelul de certificat BOV-X (punctul 10.8a), OVI-X (punctul 10.6a) și RUM (punctul 10.7a)

«B»

:

Garanții referitoare la testele de depistare a bolii veziculoase a porcului și a pestei porcine clasice efectuate asupra unor animale certificate în conformitate cu modelul de certificat POR-X (punctul 10.4a) și SUI (punctul 10.4a)

«C»

:

Garanții referitoare la testele de depistare a brucelozei efectuate asupra unor animale certificate în conformitate cu modelul de certificat POR-X (punctul 10.4a) și SUI (punctul 10.4a)

(a)

Certificatele sanitar-veterinare se întocmesc de țara exportatoare pe baza modelelor prevăzute la partea 2 din anexa I, în conformitate cu modelul corespunzător animalelor în cauză. Ele conțin, numerotate conform modelului, atestările solicitate pentru orice țară terță și, după caz, garanțiile suplimentare cerute pentru țara terță exportatoare sau o regiune a acesteia.

În cazul în care statul membru de destinație cere acest lucru pentru animalele în cauză, se adaugă cerințele suplimentare de certificare în formularul original al certificatului sanitar-veterinar.

(b)

Trebuie să se furnizeze un certificat individual și unic pentru animalele exportate dintr-un singur teritoriu prevăzut în coloanele 2 și 3 partea 1 din anexa I, care se expediază spre aceeași destinație și se transportă în același vagon sau camion, aceeași aeronavă sau navă.

(c)

Originalul fiecărui certificat se compune dintr-o singură foaie, recto și verso, sau, în cazul în care sunt necesare mai multe informații, este prezentat astfel încât toate foile să facă parte dintr-un tot unitar și indivizibil.

(d)

Certificatul se întocmește în cel puțin una dintre limbile statului membru UE în care se efectuează controlul la punctul de control la frontieră și cea a statului membru UE de destinație. Cu toate acestea, statele membre în cauză pot să autorizeze folosirea altei limbi comunitare în locul limbii lor și să prevadă, după caz, o traducere oficială.

(e)

În cazul în care se anexează pagini suplimentare la certificat, din motive de identificare a diferitelor elemente ale lotului (tabelul de la punctul 8.2 din modelul de certificat), aceste pagini se consideră, de asemenea, ca făcând parte din originalul certificatului prin aplicarea, pe fiecare pagină, a semnăturii și a ștampilei medicului veterinar oficial responsabil cu certificarea.

(f)

În cazul în care certificatul, inclusiv tabelele suplimentare prevăzute la litera (e), se compune din mai multe pagini, fiecare pagină se numerotează în josul paginii – (numărul paginii) din (numărul total de pagini) – și este prevăzută, sus, cu numărul de cod al certificatului atribuit de autoritatea competentă.

(g)

Originalul certificatului trebuie completat și semnat de către un medic veterinar oficial în termenul de 24 de ore care precedă încărcarea lotului pentru export în Comunitate. Astfel, autoritățile competente din țara exportatoare asigură respectarea principiilor de certificare echivalente cu cele stabilite de Directiva 96/93/CE a Consiliului.

Culoarea semnăturii este diferită de cea a textului. Această regulă se aplică și pentru alte ștampile, cu excepția celor în relief sau filigranate.

(h)

Originalul certificatului trebuie să însoțească lotul până la punctul de control la frontieră UE.

(i)

Certificatul este valabil 10 zile de la data emiterii.

În cazul transportului pe cale navigabilă, durata valabilității se prelungește cu durata călătoriei maritime. În acest sens, se anexează la certificatul sanitar-veterinar o declarație, în original, a căpitanului navei, întocmită în conformitate cu addendumul din partea 3A a anexei I la prezenta decizie.

(j)

Animalele nu se vor transporta împreună cu alte animale care fie nu sunt destinate Comunității Europene, fie prezintă o stare de sănătate inferioară.

(k)

În timpul transportului spre Comunitatea Europeană, animalele nu se descarcă pe teritoriul unei țări sau al unei regiuni a unei țări care nu este autorizată pentru importul acestor animale în Comunitate.

I.

Se află sub controlul unui medic veterinar oficial.

II.

Toate sunt situate în centrul unei zone cu diametru de 20 km în care, în conformitate cu constatările oficiale, nu s-a raportat nici un caz de febră aftoasă cu cel puțin 30 de zile înainte de utilizarea lor ca centre desemnate.

III.

Înainte de a fi utilizate ca centre desemnate, se curăță și se dezinfectează cu un dezinfectant autorizat oficial în țara exportatoare pentru a combate eficient boala menționată la punctul II anterior.

IV.

Dispun, ținând seama de capacitatea lor de adăpostire, (a) de o instalație destinată exclusiv acestei utilizări; (b) instalații corespunzătoare, ușor de curățat și de dezinfectat, pentru a încărca și a descărca animalele, pentru a le adăposti în condiții adecvate, a le adăpa și hrăni și pentru a le administra orice tratament necesar; (c) instalații corespunzătoare pentru inspecții și izolare; (d) echipament adecvat pentru curățarea și dezinfectarea sălilor și a camioanelor; (e) o suprafață suficientă de depozitare a furajelor, așternutelor de paie și a gunoiului de grajd; (f) sisteme adecvate de colectare și eliminare a apelor reziduale; (g) un birou pentru medicul veterinar oficial.

V.

Când funcționează, dispun de un număr suficient de medici veterinari care să efectueze toate sarcinile ce le revin.

VI.

Acceptă doar animale identificate individual pentru a garanta trasabilitatea. În acest sens, în cazul în care animalele sunt acceptate, proprietarul sau persoana responsabilă cu centrul se asigură că animalele sunt identificate corespunzător și sunt însoțite de documentele sau certificatele de sănătate animală pentru speciile și categoriile în cauză. În plus, această persoană înregistrează într-un registru sau o bază de date și păstrează pentru cel puțin trei ani numele proprietarului, originea, data intrării, data ieșirii, numărul și identificarea animalelor sau numărul de înregistrare a șeptelului de origine și destinația animalelor, precum și numărul de înregistrare a transportatorului și numărul de înregistrare a camionului care livrează sau încarcă animalele din instalații.

VII.

Toate animalele care trec prin aceste centre îndeplinesc condițiile de sănătate stabilite pentru importul în Comunitatea Europeană de animale din categoriile relevante.

VIII.

Animalele care urmează să fie exportate în Comunitatea Europeană și care trec printr-un centru de adunare trebuie, la șase zile de la sosire, să fie îmbarcate și expediate direct spre frontiera țării exportatoare: (a) fără să vină în contact cu alte animale biongulate decât cele care îndeplinesc condițiile de sănătate stabilite pentru importul în Comunitatea Europeană al categoriei relevante de animale; (b) repartizate în loturi, astfel încât un lot să nu conțină în același timp animale reproducătoare sau pentru producție și animale destinate sacrificării imediate; (c) în vehicule de transport sau containere care au fost curățate și dezinfectate în prealabil cu un dezinfectant autorizat oficial în țara exportatoare pentru a combate eficient boala menționată la punctul II anterior și care sunt construite astfel încât materiile fecale, urina, așternutul de paie sau furajele să nu se scurgă sau să nu cadă în timpul transportului.

IX.

În cazul în care condițiile stabilite pentru exportul animalelor în Comunitate impun efectuarea unui test, înainte de îmbarcare, într-un termen precizat, acest termen include orice perioadă de adunare, limitată la șase zile, de la sosirea animalelor în centrele desemnate.

X.

Țara exportatoare specifică centrele desemnate pentru animalele reproducătoare și pentru producție și centrele desemnate pentru animalele destinate sacrificării și notifică numele și adresele acestor centre, precum și actualizările succesive, Comisiei și autorităților centrale competente ale statelor membre.

XI.

Țara exportatoare stabilește procedura conform căreia se efectuează supravegherea oficială a centrelor desemnate și garantează aplicarea acestei supravegheri.

XII.

Se inspectează în mod regulat pentru a se confirma că cerințele de desemnare sunt îndeplinite în continuare. În caz de nerespectare a cerințelor sau de suspendare a activității, desemnarea se poate reinstitui doar în cazul în care autoritatea competentă s-a asigurat că centrul respectă în totalitate cerințele menționate anterior.

Testul ELISA de competitie, care utilizează anticorpul monoclonal 3-17-A3, este capabil să identifice anticorpi pentru toate serotipurile cunoscute ale virusului bolii limbii albastre (BTV).

Principiul testului este întreruperea unei reacții între antigenul BTV și un anticorp monoclonal specific de grup (3-17-A3) prin adăugarea de ser de testare. Anticorpii de BTV prezenți în serul de testare blochează reactivitatea anticorpului monoclonal (AcM) și cauzează o reducere a dezvoltării scontate a culorii după adăugarea unui anticorp antișoarece marcat enzimatic și a cromogenului/substratului. Serurile pot fi testate într-o singură diluție de 1:5 (testul spot – apendicele 1) sau pot fi titrate (titrarea serului – apendicele 2) pentru a defini punctele limită de diluție. Valorile de inhibiție mai mari decât 50 % pot fi considerate pozitive.

1.

Plăci de microtitrare ELISA adecvate.

2.

Antigen: furnizat sub formă de concentrat celular, preparat după procedura descrisă în continuare și păstrat la o temperatură de – 20 °C sau – 70 °C.

3.

Tampon de blocare: tampon fosfat salin(PBS) ce conține 0,3 % ser bovin negativ în raport cu virusul bolii limbii albastre, 0,1 % (v/v) Tween-20 (furnizat sub formă de sirop de polioxietilenă sorbiton monolaurat) în PBS.

4.

Anticorp monoclonal: 3-17-A3 (furnizat sub formă de supernatant din cultură tisulară hibridom) îndreptat împotriva polipeptidei VP7 specifice, păstrat la – 20 °C sau liofilizat și diluat la 1/100 cu tampon de blocare înainte de utilizare.

5.

Conjugat: globulină de iepure antișoarece (adsorbită și eluată) conjugată cu peroxidază din hrean și păstrat la întuneric la 4 °C.

6.

Cromogen și substrat: Ortofenilen diamină (cromogen OFD) a cărei concentrație finală este de 0,4 mg/ml în apă distilată sterilă. Peroxid de hidrogen (substrat 30 % w/v), 0,05 % v/v adăugat imediat înainte de utilizare (5µl H2O2 per 10 ml OFD). (A se manevra OFD cu grijă – A se folosi mănuși din cauciuc – Produs posibil mutagen).

7.

Acid sulfuric: solutie acid sulfuric 1M, 26,6 ml de acid adăugat la 473,4 ml de apă distilată. (Atenție – întotdeauna se adaugă acidul în apă, nu apa în acid.)

8.

Agitator orbital.

9.

Cititor de plăci ELISA (testul se poate citi si cu ochiul liber).

Control conjugat (Cc)

:

Godeurile 1A și 1B corespund controlului de blank ce cuprinde antigenul BTV și un conjugat. Se poate utiliza pentru a etalona cititorul ELISA.

Control AcM (Cm)

:

Coloanele 1 și 2, rândurile G și H corespund controlului anticorpului monoclonal ce cuprinde antigenul BTV, anticorpul monoclonal și conjugatul. Aceste godeuri reprezintă culoarea cea mai pronunțată. Media valorilor densității optice ale acestui control reprezintă valoarea de inhibiție 0 %.

Control pozitiv (C++, C+)

:

Coloanele 1 și 2, rândurile C, D, E și F. Aceste godeuri cuprind antigenul BTV, antiserul puternic pozitiv și, respectiv, slab pozitiv, AcM și conjugatul.

Control negativ (C–)

:

Godeurile 2A și 2B corespund controalelor negative, care cuprind antigenul BTV, antiserul BTV negativ, AcM și conjugatul.

Ser de testare

:

Pentru studii serologice la scară mare și teste de control rapide, serurile se pot testa într-o diluție unică 1:5 (apendicele 1). Eventual, 10 seruri se pot testa într-o serie de diluții de la 1:5 până la 1:640 (apendicele 2). Vor rezulta informații cu privire la titrul anticorpului din serul de testare.

1.

Se diluează antigenul BTV la concentrația pretitrată în PBS, se agită energic cu ajutorul unui aparat cu ultrasunete pentru a dispersa agregatele de virus (în absența unui aparat cu ultrasunete, se agită puternic cu pipeta) și se adaugă 50 µl în toate godeurile plăcii ELISA. Se loveste usor placa de masa pentru a dispersa antigenul.

2.

Se incubează pentru 60 de minute la 37 °C într-un incubator-agitator. Se spală plăcile de trei ori prin umplearea și se golirea godeurilor cu PBS nesteril și se usucă cu hârtie sugativă.

3.

Godeurile de control: Se adaugă 100 µl tampon de blocare în godeurile Cc. Se adaugă 50 µl de ser de control pozitiv și negativ, într-o diluție de 1:5 (10 µl de ser + 40 µl de tampon de blocare), în godeurile C–, C + și, respectiv, C++. Se adaugă 50 µl de tampon de blocare în godeurile de control AcM.

Metoda de titrare unică: Se adaugă fiecare ser de testare in dilutie de 1:5 cu tampon de blocare, in duplicat, in godeurile coloanelor de la 3 la 12 (10 µl de ser + 40 µl de tampon de blocare), conform schemei anterioare.

sau

Metoda de titrare a serului: Se prepară o serie de diluții în progresie geometrică ale fiecărui eșantion de testare (de la 1:5 la 1:640) într-un tampon de blocare in cele opt godeuri ale fiecărei coloane de la 3 la 12.

4.

Imediat după adăugarea serului de testare, se diluează AcM la 1:100 într-un tampon de blocare și se adaugă 50 µl în toate godeurile plăcii, cu excepția blank-ului.

5.

Se incubează pentru 60 de minute la 37 °C. Se spală de trei ori cu PBS și se usucă cu hârtie sugativă.

6.

Se diluează concentratul de iepure antișoarece la 1/5 000 într-un tampon de blocare și se adaugă 50 µl în toate godeurile plăcii.

7.

Se incubează pentru 60 de minute la 37 °C. Se spală de trei ori cu PBS și se usucă cu hârtie sugativă.

8.

Se decongelează OPD și, imediat înainte de utilizare, se adaugă 5 µl de peroxid de hidrogen 30 % la fiecare 10 ml de OPD. Se adaugă 50 µl în toate godeurile plăcii. Se așteaptă dezvoltarea culorii pentru aproximativ 10 minute și se întrerupe reacția cu acid sulfuric 1M (50 µl pe godeu). Culoarea ar trebui să se dezvolte în godeurile de control AcM și în godeurile ce conțin ser fără anticorpi de BTV.

9.

Se examinează și se înregistrează plăcile fie cu ochiul liber, fie folosind un cititor spectrofotometric.

1.

Se spală de trei ori 40-60 de linii celulare BHK-21 confluente cu mediu Eagle fără ser și se infectează cu serotipul 1 al virusului bolii limbii albastre în mediul Eagle fără ser.

2.

Se incubează la 37 °C și se examinează zilnic efectul citopatic (CPE).

3.

Când CPE este complet în 90-100 % din placa fiecarei linii celulare, se recoltează virusul agitând pentru a desprinde celulele aderente la pereți.

4.

Se centrifughează la 2 000-3 000 rpm pentru a fragmenta celulele.

5.

Se elimină supernatantul și se repun celulele în suspensie în aproximativ 30 ml de PBS ce conține 1 % «Sarkosyl» și 2 ml de fluorură de fenilmetilsulfonil (tampon de liză). Poate rezulta gelificarea celulelor, caz în care se mai adaugă tampon de liză pentru a reduce acest efect. (NB: fluorura de fenilmetilsulfonil este periculoasă – a se manevra cu extremă precauție.)

6.

Se disociază celulele timp de 60 de secunde cu ajutorul unei sonde ultrasonice la o amplitudine de 30 microni.

7.

Se centrifughează la 10 000 rpm pentru 10 minute.

8.

Se depozitează supernatantul la + 4 °C și se repune în suspensie fragmentul de celulă rămas în 10-20 ml de tampon de liză.

9.

Se agită cu ajutorul unui aparat cu ultrasunete și se clarifică, de trei ori în total, stocând supernatantul în fiecare stadiu.

10.

Se reunesc supernatanții și se centrifughează la 24 000 rpm (100 000 g) pentru 120 de minute la + 4 °C peste o perniță de 5ml de sucroză la 40 % (m/v în PBS) cu ajutorul unor tuburi de centrifugare Beckmann de 30 ml și al unui rotor SW 28.

11.

Se elimină supernatantul, se lasă tuburile să se scurgă bine și se repune în suspensie fragmentul în PBS prin sonicare. Se stochează antigenul în părți alicote la – 20 °C.

1.

Se titrează antigenul BTV în PBS la o diluție de 1:20 pe o placă de microtitrare într-o serie de diluții în progresie geometrică (50 µl/godeu) utilizând o pipetă multicanal.

2.

Se incubează o oră la 37 °C într-un agitator orbital.

3.

Se spală plăcile de trei ori cu PBS.

4.

Se adaugă 50 µl de anticorp monoclonal 3-17-A3 (diluat la 1/100) în fiecare godeu al plăcii de microtitrare.

5.

Se incubează o oră la 37 °C într-un incubator-agitator.

6.

Se spală plăcile de trei ori cu PBS.

7.

Se adaugă 50 µl de globulină de iepure antișoarece conjugată cu peroxidază din hrean, diluată la o concentrație pretitrată optimă, în fiecare godeu al plăcii de microtitrare.

8.

Se incubează o oră la 37 °C.

9.

Se adaugă substrat și cromogen după indicațiile anterioare. Se întrerupe reacția după 10 minute prin adăugarea acidului sulfuric 1 M (50 µl/godeu).

Procedura

:

Se toarnă agaroză 1 % preparată în tampon de borat sau de barbitol de sodiu, pH de la 8,5 la 9,0, într-o placă Petri de o adâncime minimă de 3,0 mm. O secvență de testare din șapte godeuri lipsite de umiditate, fiecare cu un diametru de 5,0 mm, este tăiată în agar. Secvența constă într-un godeu central si șase godeuri aranjate în jurul lui într-un cerc cu o rază de 3 mm. Godeul central este umplut cu antigenul standard. Godeurile periferice 2, 4 și 6 sunt umplute cu ser pozitiv cunoscut, iar godeurile 1, 3 și 5 sunt umplute cu seruri de testare. Sistemul este incubat o perioadă de până la 72 de ore la temperatura ambiantă, într-o etuvă umedă închisă.

Interpretarea

:

Un ser de testare este pozitiv în cazul în care formează o linie de precipitare specifică cu antigenul și formează o linie completă de identitate cu serul de control. Un ser de testare este negativ în cazul în care nu formează o linie specifică cu antigenul și nu deviază curba serului de control. Plăcile Petri trebuie să fie examinate pe fond întunecat și utilizându-se iluminare indirectă.

Procedura

:

Se toarnă agaroză 1 % preparată în tampon de borat sau de barbitol de sodiu, pH de la 8,5 la 9,0, într-o placă Petri de o adâncime minimă de 3,0 mm. O secvență de testare din șapte godeuri lipsite de umiditate, fiecare cu un diametru de 5,0 mm, este tăiată în agar. Secvența constă într-un godeu central si șase godeuri aranjate în jurul lui într-un cerc cu o rază de 3 mm. Godeul central este umplut cu antigenul standard. Godeurile periferice 2, 4 și 6 sunt umplute cu ser pozitiv cunoscut, iar godeurile 1, 3 și 5 sunt umplute cu seruri de testare. Sistemul este incubat o perioadă de până la 72 de ore la temperatura ambiantă, într-o etuvă umedă închisă.

Interpretarea

:

Un ser de testare este pozitiv în cazul în care formează o linie de precipitare specifică cu antigenul și formează o linie completă de identitate cu serul de control. Un ser de testare este negativ în cazul în care nu formează o linie specifică cu antigenul și nu deviază curba serului de control. Plăcile Petri trebuie să fie examinate pe fond întunecat și utilizându-se iluminare indirectă.

Ser

:

Toate serurile sunt inactivate la căldură (56 °C) pentru 30 de minute înainte de utilizare.

Procedură

:

Pentru testul de seroneutralizare constantă a diferitelor tipuri de virusuri, realizat pe plăci de microtitrare, se folosesc celulele MDBK sau alte celule corespunzătoare. Tulpina Colorado, Oxford sau orice altă tulpina de referință a virusului se folosește la o doză de 100 TCID50 pentru 0,025 ml; se amestecă eșantioane de ser nediluat inactivat cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie virală. Se incubează amestecurile de ser/virus la temperatura de 37 °C pentru 24 de ore în plăcile de microtitrare, înainte de adăugarea celulelor MDBK. Celulele sunt folosite la o concentrație care formează un monostrat complet după 24 de ore.

Controale

:

(i) controlul infecțiozității virusului; (ii) controale de toxicitate a serului; (iii) controale de culturi celulare neinoculate; (iv) antiseruri de referință.

Interpretare

:

Rezultatele testului de neutralizare și titrul virusului folosit la testare se înregistrează după trei până la șase zile de incubare la temperatura de 37 °C. Titrurile serului se consideră negative, în cazul în care nu există nici o neutralizare la o diluție de 1/2 (ser nediluat).

Reactivi

:

Înainte de prelevare, se prepară mediul de transport. Se repartizează un volum de 2 ml într-un număr de containere egal cu numărul de animale care vor fi testate. Containerele utilizate trebuie să reziste la congelare cu CO2 solid sau azot lichid. Eșantioanele se obțin cu ajutorul unui tampon de recoltat sputa sau «probang». Pentru a preleva un eșantion, se trece dispozitivul probang prin gură peste limbă și până la partea superioară a esofagului. Se încearcă raclarea epiteliului la suprafața părții superioare a esofagului și a faringelui prin mișcări laterale și verticale. Dispozitivul probang este apoi retras, de preferință, după ce animalul a înghițit. Dispozitivul probang trebuie să fie plin și să conțină un amestec de mucus, salivă, fluid esofagian și fragmente celulare. Trebuie să se ia măsuri ca fiecare specimen să conțină material celular vizibil. Trebuie evitate mișcările violente care pot provoca sângerări. Eșantioanele prelevate de la anumite animale pot fi puternic contaminate cu conținut ruminal. În acest caz, aceste eșantioane se elimină și se spală gura animalului cu apă sau cu lichid fiziologic înainte de repetarea operației de prelevare.

Tratamentul eșantioanelor

:

Se examinează calitatea fiecărui eșantion colectat în dispozitivul probang și se adaugă 2 ml din acest conținut într-un volum egal de mediu de transport într-un container rezistent la congelare. Containerele sunt închise ermetic, sigilate, dezinfectate și etichetate. Eșantioanele se păstrează la rece (+ 4 °C) și se examinează după trei până la patru ore sau se plasează în gheață uscată (– 69 °C) sau în azot lichid și se păstrează congelate până la examinare. Între două prelevări, dispozitivul probang se dezinfectează și se clătește de trei ori cu apă curată.

Test de depistare a virusului FMD

:

Eșantioanele se inoculează în culturi celulare primare de tiroidă bovină, folosindu-se cel puțin trei tuburi pentru fiecare eșantion. Se pot folosi alte celule corespunzătoare, precum celulele primare de rinichi de bovine sau porcine, dar ar trebui să se țină seama că aceste celule sunt mai puțin sensibile la anumite tulpini ale virusului FMD. Tuburile se incubează la 37 °C într-un aparat cu rotile și se examinează zilnic timp de 48 de ore pentru a detecta prezența efectului citopatic (CPE). În cazul în care sunt negative, culturile se transfera în alte culturi și se reexaminează timp de 48 de ore. Trebuie să se confirme specificitatea oricărui CPE.

1.

Tampon fosfat de 0,08 M, la pH 7,2, conținând albumină din ser bovin 0,01 %, roșu fenol 0,002 % și antibiotice.

2.

Mediu de cultură tisulară (de exemplu, Eagle MEM) conținând tampon Hepes 0,04 M, albumină dein ser bovin l0,01 % și antibiotice, pH 7,2.

3.

Ar trebui să se adauge antibiotice în cantitățile următoare pe ml final de mediu de transport, de exemplu penicilină 1 000 UI, sulfat de neomicină 100 UI, sulfat de polimixină B 50 UI, micostatin 100 UI.

Reactivi

:

Se prepară antigenul stoc FMDV în culturi celulare sau pe limbi de bovine și se păstrează la o temperatură de – 70 °C sau mai mică sau la o temperatură de – 20 °C după adăugarea de glicerol la 50 %. Acesta constituie antigenul stoc. În aceste condiții, virusul FMD este stabil și titrurile variază foarte puțin pe o perioadă de câteva luni.

Procedură

:

Testul se realizează pe plăci de microtitrare cu fund plat, prevăzute pentru culturi tisulare, folosind celule sensibile ca IB-RS-2, BHK-21 sau celule de rinichi de vițel. Se diluează la 1/4 serurile de testare într-un mediu de culturi celulare fără ser, la care se adaugă 100 UI/ml de neomicină sau alte antibiotice adecvate. Serurile se inactivează la temperatura de 56 °C timp de 30 de minute și se folosesc volume de 0,05 ml din acestea pentru prepararea unor serii duble pe plăci de microtitrare cu ajutorul unei anse de diluție de 0,05 ml. Se adaugă apoi în fiecare godeu virus pretitrat, diluat de asemenea în mediu de cultură fără ser, conținând 100 TCID50/0,05 ml. După incubarea la temperatura de 37 °C timp de o oră pentru a permite reacția de neutralizare, se adaugă în fiecare godeu 0,05 ml de suspensie celulară ce conține 0,5-1,0 × 106 celule la 1 ml într-un mediu de cultură celulară conținând ser fără anticorpi de FMD, iar plăcile se sigilează. Plăcile se incubează la temperatura de 37 °C. Monostraturile devin în mod normal confluente în 24 de ore. CPE este în mod normal suficient de dezvoltat în 48 de ore pentru a permite o citire microscopică a testului. În acest moment, se poate efectua o citire microscopică finală sau plăcile se pot fixa și colora în vederea unei citiri macroscopice, utilizând, de exemplu, solutie salină formolată 10 % și albastru de metilen 0,05 %.

Controale

:

Controalele fiecărui test cuprind un antiser omolog de un titru cunoscut, un control al celulelor, un control de toxicitate a serului, un control al mediului și o titrare a virusului pe baza căreia se calculează cantitatea reală a virusului utilizată în test.

Interpretare

:

Godeurile care prezintă CPE sunt considerate infectate și titrurile de neutralizare sunt exprimate ca reprezentând reciproca diluției finale de ser prezent în amestecurile de ser/virus la punctul final de 50 % estimat după metoda Spearman-Karber. (Karber, G., 1931, Archiv fuer Experimentelle Pathologie und Pharmakologie, 162, 480). Testele se consideră valide în cazul în care cantitatea reală de virus folosită pentru fiecare godeu este cuprinsă între 101,5 și 102,5 TCID50 și titrul serului de referință nu variază cu un factor mai mare de 2 față de titrul anticipat, estimat după modul titrărilor precedente. În cazul în care controalele se găsesc în afara acestor limite, se repetă testele. Un titru final de 1/11 sau mai mic se consideră negativ.

Reactivi

:

Antiseruri de iepure față de șapte tipuri de antigenul 146S al virusului febrei aftoase (FMDV) folosite la o concentrație optimă predeterminată într-un tampon de carbonat/bicarbonat cu pH 9,6. Se prepară antigene din tulpinile de virus selectate, cultivate pe monostraturi de celule BHK-21. Se utilizează supernatanți nepurificați și se pretitrează conform protocolului, dar fără ser, pentru a da o diluție care, după adăugarea unui volum egal de PBST (tampon fosfat salin, conținând 0,05 % Tween-20 și indicator roșu fenol) ar da o densitate optică între 1,2 și 1,5. Virusurile pot fi folosite inactivate. PBST este folosit ca diluant. Se prepară antiseruri de cobai prin inocularea cobailor cu antigen 146S din fiecare serotip. Se prepară o concentrație optimă predeterminată în PBST, ce conține 10 % ser bovin normal și 5 % ser normal de iepure. Se folosește imunoglobulină de iepure anticobai conjugată cu peroxidază din hrean la o concentrație optimă predeterminată în PBST, ce conține 10 % ser normal bovin și 5 % ser normal de iepure. Serurile de testare se diluează în PBST.

1.

Plăcile ELISA se acoperă cu 50 µl de seruri antivirale de iepure și se lasă peste noapte într-o încăpere umedă, la temperatura ambiantă.

2.

În plăci de microtitrare cu godeuri multiple și cu fundul rotund (plăci purtătoare), se prepară, la un volum de 50 microlitri, serii de diluții în progresie geometrică, in duplicat, din fiecare ser de testare începând cu diluția 1/4. Se adaugă în fiecare godeu 50 microlitri dintr-o doză constantă de antigen și amestecurile se lasă peste noapte la temperatura de 4 °C. Adăugarea antigenului reduce diluția serică inițială la 1/8.

3.

Se spală plăcile ELISA cu PBST de cinci ori.

4.

Se transferă apoi 50 microlitri de amestecuri ser/antigen din plăcile purtătoare în plăcile ELISA acoperite cu ser de iepure și se incubează la temperatura de 37 °C timp de o oră într-un agitator rotativ.

5.

După spălare, se adaugă în fiecare godeu 50 µl de antiser de cobai la antigenul folosit la punctul 4. Se incubează plăcile la temperatura de 37 °C timp de o oră într-un agitator rotativ.

6.

Se spală plăcile și se adaugă în fiecare godeu 50 µl de imunoglobulină de iepure anticobai, conjugată cu peroxidază din hrean. Plăcile se incubează la temperatura de 37 °C timp de o oră într-un agitator rotativ.

7.

Se spală plăcile și se adaugă în fiecare godeu 50 µl de ortofenilen diamină, ce conține 0,05 % H2O2 (30 %) m/v.

8.

După 15 minute se întrerupe reacția cu H2SO4 de 1,25 M.

Controale

:

Pentru fiecare antigen utilizat, 40 de godeuri nu conțin ser, ci antigen diluat într-un PBST. O serie dublă de diluții în progresie geometrică de antiser bovin omolog de referință. O serie dublă de diluții în progresie geometrică de ser bovin negativ.

Interpretare

:

Titrurile anticorpilor sunt exprimate ca reprezentând diluția finală a serurilor de testare, dând 50 % din valoarea medie DO înregistrate în godeurile de control al virusului, unde serul de testare lipsește. Titrurile superioare valorii de 1/40 sunt considerate pozitive.

Referințe

:

Hamblin C., Barnett ITR și Hedger RS (1986), «A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA.» [Un nou test de imunoadsorbție cu anticorpi marcați enzimatic (ELISA) pentru detectarea anticorpilor virusului febrei aftoase] Journal of Immunological Methods, 93, 115 la 121.11.

Ser

:

Toate serurile sunt inactivate la căldură (56 °C) pentru 30 de minute înainte de utilizare.

Procedură

:

Pentru testul de seroneutralizare constantă a diferitelor tipuri de virusuri, realizat pe plăci de microtitrare, se folosesc sistemele de celulele Vero sau alte celule sensibile. Virusul bolii Aujeszky se folosește la o doză de 100 TCID50 pentru 0,025 ml; se amestecă eșantioane de ser nediluat inactivat cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie virală. Se incubează amestecurile de ser/virus la temperatura de 37 °C pentru 2 ore, în plăcile de microtitrare, înainte de adăugarea celulelor adecvate. Celulele sunt folosite la o concentrație care formează un monostrat complet după 24 de ore.

Controale

:

(i) controlul infecțiozității virusului; (ii) controale de toxicitate a serului; (iii) controale de culturi celulare neinoculate; (iv) antiseruri de referință.

Interpretare

:

Rezultatele testului de neutralizare și titrul virusului folosit la testare se înregistrează după trei până la șase zile de incubare la temperatura de 37 °C. Titrurile serului mai mici decât 1/2 (ser nediluat) se consideră negative.

Ser

:

Toate serurile sunt inactivate la căldură (56 °C) pentru 30 de minute înainte de utilizare.

Procedură

:

Pentru testul de seroneutralizare constantă a diferitelor tipuri de virusuri, realizat pe plăci de microtitrare, se folosesc sistemele de celulele A72 (tumori de câine) sau alte celule sensibile. Virusul TGE se folosește la o doză de 100 TCID50 pentru 0,025 ml; se amestecă eșantioane de ser nediluat inactivat cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie virală. Se incubează amestecurile de ser/virus la temperatura de 37 °C pentru 30 până la 60 de minute, în plăcile de microtitrare, înainte de adăugarea celulelor adecvate. Celulele sunt folosite la o concentrație care formează un monostrat complet după 24 de ore. Se toarnă în fiecare godeu 0,1 ml de suspensie celulară.

Controale

:

(i) controlul infecțiozității virusului; (ii) controale de toxicitate a serului; (iii) controale de culturi celulare neinoculate; (iv) antiseruri de referință.

Interpretare

:

Rezultatele testului de neutralizare și titrul virusului folosit la testare se înregistrează după trei până la cinci zile de incubare la temperatura de 37 °C. Titrurile serului mai mici decât 1/2 (diluție finală) se consideră negative. În cazul în care eșantioanele de ser nediluat sunt toxice pentru culturile tisulare, aceste seruri se pot dilua în proporție de 1/2 înainte de a fi utilizate în test. Acest lucru corespunde unei diluții finale a serului de 1/4. În aceste cazuri, titrurile serului mai mici decât 1/4 (diluție finală) se consideră negative.

«1»

:

Restricții geografice și temporale

«2»

:

Restricții pe categorie

Nu se autorizează nici un organ comestibil (cu excepția diafragmei și a mușchilor maseteri ai bovinelor).

«BOV»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru carne proaspătă provenită de la animale domestice din specia bovină (Bos taurus, Bison bison, Bubalus bubalisși hibrizii lor)

«POR»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru carne proaspătă provenită de la animale domestice din specia porcină (Sus scrofa)

«OVI»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru carne proaspătă provenită de la animale domestice din specia ovină (Ovis aries) și caprină (Capra hircus)

«EQU»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru carne proaspătă provenită de la animale domestice din specia ecvină (Equus caballus, Equus asinusși hibrizii lor)

«RUF»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru carne proaspătă provenită de la animale nedomestice de crescătorie, altele decât suidele și solipedele

«RUW»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru carne proaspătă provenită de la animale sălbatice din specii nedomestice, altele decât suidele și solipedele

«SUF»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru carne proaspătă provenită de la suide nedomestice de crescătorie

«SUW»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru carne proaspătă provenită de la suide sălbatice din specii nedomestice

«EQW»

:

Model de certificat sanitar-veterinar pentru carne proaspătă provenită de la solipede sălbatice din specii nedomestice

«A»

:

garanții referitoare la maturarea, măsurarea pH-ului și dezosarea cărnii proaspete, cu excepția organelor comestibile, certificate în conformitate cu modelele de certificate BOV (punctul 10.6), OVI (punctul 10.6), RUF (punctul 10.7) și RUW (punctul 10.4)

«B»

:

garanții referitoare la organele comestibile prelucrate și maturate, descrise îm modelul de certificat BOV (punctul 10.6)

«C»

:

garanții referitoare la testul de laborator privind pesta porcină clasică efectuat asupra carcaselor din care s-a obținut carnea proaspătă certificată în conformitate cu modelul de certificat SUW [punctul 10.3 (a)]

«D»

:

garanții referitoare la hrănirea, în exploatație (exploatații), cu deșeuri alimentare lichide a animalelor din care s-a obținut carnea proaspătă certificată în conformitate cu modelele de certificat POR [punctul 10.3 (d)]

«E»

:

garanții referitoare la testul de tuberculoză efectuat asupra animalelor din care s-a obținut carnea proaspătă certificată în conformitate cu modelul de certificat BOV [punctul 10.4 (d)]

«F»

:

garanții referitoare la maturarea și dezosarea cărnii proaspete, cu excepția organelor comestibile, certificate în conformitate cu modelele de certificate BOV (punctul 10.6), OVI (punctul 10.6), RUF (punctul 10.7) și RUW (punctul 10.4)

(a)

Certificatele sanitar-veterinare sunt întocmite de țara exportatoare pe baza modelelor prevăzute la partea 2 din anexa II, în conformitate cu modelul corespunzător cărnii în cauză. Ele conțin, numerotate conform modelului, atestările solicitate pentru orice țară terță și, după caz, garanțiile suplimentare cerute pentru țara terță exportatoare sau o regiune a acesteia.

(b)

Trebuie să se furnizeze un certificat individual și unic pentru carnea exportată dintr-un singur teritoriu prevăzut în coloanele 2 și 3, partea 1 din anexa II, ce este expediată spre aceeași destinație și transportată în același vagon sau camion, aceeași aeronavă sau navă.

(c)

Originalul fiecărui certificat se compune dintr-o singură foaie, recto și verso, sau, în cazul în care sunt necesare mai multe informații, este prezentat astfel încât toate foile să facă parte dintr-un tot unitar și indivizibil.

(d)

Certificatul se întocmește în cel puțin una dintre limbile statului membru UE în care se efectuează controlul la punctul de control la frontieră și cea a statului membru UE de destinație. Cu toate acestea, statele membre în cauză pot să autorizeze folosirea altor limbi și să prevadă, după caz, o traducere oficială.

(e)

În cazul în care se anexează pagini suplimentare la certificat, din motive de identificare a diferitelor elemente ale lotului (tabelul de la punctul 8.3 din modelul de certificat), aceste pagini se consideră, de asemenea, ca făcând parte din originalul certificatului prin aplicarea, pe fiecare pagină, a semnăturii și a ștampilei medicului veterinar oficial responsabil cu certificarea.

(f)

În cazul în care certificatul, inclusiv tabelele suplimentare prevăzute la litera (e), se compune din mai multe pagini, fiecare pagină se numerotează în josul paginii – (numărul paginii) din (numărul total de pagini) – și este prevăzută, sus, cu numărul de cod al certificatului atribuit de autoritatea competentă.

(g)

Originalul certificatului trebuie completat și semnat de către un medic veterinar oficial. Astfel, autoritățile competente din țara exportatoare asigură respectarea principiilor de certificare echivalente cu cele stabilite de Directiva 96/93/CE a Consiliului.

Culoarea semnăturii este diferită de cea a textului. Această regulă se aplică și pentru alte ștampile, cu excepția celor în relief sau filigranate.

(h)

Originalul certificatului trebuie să însoțească lotul până la punctul de control la frontieră UE.