L_2005059RO.01002001.xml

de stabilire a notelor explicative ce completează partea B din anexa II la Directiva 90/219/CEE a Consiliului privind utilizarea în condiții de izolare a microorganismelor modificate genetic

având în vedere Directiva 90/219/CEE a Consiliului din 23 aprilie 1990 privind utilizarea în condiții de izolare a organismelor modificate genetic (1), în special paragraful introductiv al părții B din anexa II,

Notele explicative stabilite în anexa la prezenta decizie se utilizează pentru a completa partea B a anexei II la Directiva 90/219/CEE.

Adoptată la Bruxelles, 28 februarie 2005.

Pentru Comisie

Stavros DIMAS

Membru al Comisiei

Se consideră corespunzătoare pentru includere în anexa II partea C numai tipurile de MMG care îndeplinesc atât criteriile generale, cât și cele specifice stabilite în anexa II partea B.

Toate MMG-urile incluse în partea C din anexa II se vor publica în Jurnalul Oficial alături de caracteristicile de identificare sau sursele de referință pentru MMG. Pentru a determina dacă un tip de MMG se poate înscrie în partea C din anexa II, este necesar să se ia în considerare toate elementele și, după caz, procesul utilizat pentru a construi un MMG. Ar trebui să se noteze că, deși toate aspectele trebuie luate în considerare, doar proprietățile MMG-ului se vor examina pe baza criteriilor enunțate în anexa II partea B. În cazul în care toate elementele MMG-ului ar fi examinate individual și s-ar considera inofensive, este probabil că MMG-ul va îndeplini criteriile de siguranță. Cu toate acestea, acest fapt nu se presupune și trebuie să se verifice riguros.

În cazul în care MMG-urile sunt produse ca organisme intermediare pentru a obține un MMG final, acești intermediari ar trebui, de asemenea, să fie examinați pe baza criteriilor din partea B din anexa II pentru fiecare tip ce trebuie scutit, pentru a permite scutirea de facto a utilizării în condiții de izolare în ansamblu. Statele membre ar trebui să asigure aplicarea următoarelor linii directoare de către utilizatori, pentru a facilita îndeplinirea criteriilor respective în pregătirea dosarelor prin care se stabilește siguranța, pentru sănătatea oamenilor și pentru mediu, a tipurilor de MMG-uri care urmează să fie incluse în partea C din anexa II, precum și de către autoritățile competente naționale pentru a evalua respectarea reglementărilor.

Dosarele ar trebui să includă mijloace de probă detaliate și concrete pentru a permite statelor membre să verifice dacă declarațiile privind siguranța MMG-urilor în ceea ce privește criteriile menționate sunt justificate. Ar trebui să se adopte prinicipiul precauției în caz de incertitudine științifică și să un fie posibilă nici o derogare pentru MMG-uri în absența probelor convingătoare privind respectarea acestor criterii.

Autoritatea națională competentă ce primește un dosar în acest scop trebuie, în urma unei evaluări pozitive în ceea ce privește îndeplinirea criteriilor, să îl transmită Comisiei, care, la rândul său, ar trebui să consulte comitetul instituit în conformitate cu articolul 21 din directivă, cu privire la includerea MMG-ului în cauză în partea C din anexa II. Definițiile termenilor utilizați sunt prevăzute în apendicele 1.

Ar trebui să se stabilească și să se autentifice identitatea sușei și să se caracterizeze corect vectorul/insertul în ceea ce privește structura și funcția în forma în care apar în MMG-ul final. Un istoric detaliat al sușei (inclusiv istoricul modificărilor genetice) oferă informații utile pentru evaluarea siguranței. Ar trebui să se înțeleagă relația taxonomică cu microorganismele înrudite, cunoscute și dăunătoare, deoarece acest fapt poate furniza informații cu privire la eventuale caracteristici dăunătoare care nu se exprimă în mod normal, dar care s-ar putea exprima ca urmare a modificării genetice. Pentru sistemele de cultură a celulelor și țesuturilor eucariote, acestea ar trebui să fie verificate pentru a le stabili identitatea în conformitate cu clasificările internaționale (ATCC sau altele).

Ar trebui să se caute în literatura relevantă istoricul, rapoarte privind siguranța, detalii taxonomice, date cu privire la markerii fenotipici și genetici, de exemplu Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, articole și reviste științifice, informații de la societăți comerciale care furnizează ADN. Se pot obține, de asemenea, informații utile de la colecțiile de culturi și de la organizațiile de colecții de culturi, precum Federația mondială a colecțiilor de culturi (FMCC) care publică Repertoarul mondial al colecțiilor de culturi de microorganisme și Organizația europeană a colecțiilor de culturi (OECC). Ar trebui, de asemenea, să se ia în seamă marile colecții europene de culturi care păstrează vaste grupe de microorganisme. În cazul unui nou izolat sau al unei noi sușe ce nu au fost studiate în profunzime, ar trebui să se soluționeze toate problemele nerezolvate prin testele efectuate pentru confirmarea identității MMG-ului. Acest fapt ar putea surveni în cazul în care sușa MMG-ului diferă apreciabil de tulpina (tulpinile) parentală(e), de exemplu în cazul în care MMG-ul provine dintr-o fuziune de celule sau rezultă din multiple modificări genetice.

În cazul în care sunt necesare teste pentru a confirma identitatea sușei, acestea pot cuprinde morfologie, colorare, microscopie electronică, serologie, profiluri nutriționale bazate pe utilizare și/sau degradare, analiza izoenzimelor, profilul proteic și al acizilor grași, procentajul bazelor G + C %, amprentele ADN/ARN, amplificarea secvențelor ADN/ARN specifice, analiza prin sonde genetice, hibridizare cu sonde cu ADN specifice ARNr și secvențierea ADN/ARN. Rezultatele acestor teste ar trebui să fie documentate.

Situația optimă pentru identificarea genelor prezente în MMG este în cazul în care se cunoaște secvența completă de nucleotide a vectorului sau insertului. Funcția fiecărei unități genetice se poate prin urmare explica. Mărimea vectorului și insertului ar trebui să se limiteze pe cât posibil la secvențele genetice necesare pentru a îndeplini funcția dorită. Acest fapt reduce probabilitatea introducerii și exprimării unor funcții criptice sau a dobândirii unor trăsături genetice nedorite.

Ar trebui să se furnizeze dovada siguranței utilizării MMG-ului. Dovada poate include rezultatele unor teste anterioare, date extrase din literatură sau rapoarte ce atestă siguranța organismului. Ar trebui să se noteze că o siguranță a utilizării atestată nu stabilește neapărat siguranța, în special în cazul în care MMG-ul a fost utilizat în condiții riguros controlate din motive de siguranță.

Atestarea stabilită corespunzător a siguranței tulpinii receptoare sau parentale va fi un element cheie pentru a decide dacă MMG-ul îndeplinește acest criteriu. Cu toate acestea, MMG-ul poate diferi considerabil de părintele său (părinții săi), ceea ce ar putea afecta siguranța, aceste diferențe trebuind investigate. În special, ar trebui să se țină seama dacă modificarea genetică a avut ca scop eliminarea unei caracteristici dăunătoare sau patogene din tulpina receptoare sau parentală. În asemenea situații, pentru a atesta siguranța, ar trebui să se furnizeze documente justificative clare cu privire la eliminarea efectivă a caracteristicilor dăunătoare sau potențial dăunătoare. În cazul în care nu există date cu privire la tulpina receptoare sau parentală în cauză, se pot folosi date colectate pentru specie. Aceste date, sprijinite de o cercetare a literaturii și o investigare taxonomică a variației sușei în interiorul speciei, pot dovedi siguranța tulpinii receptoare sau parentale în cauză.

În absența unor informații în sprijinul atestării siguranței, ar trebui să se efectueze teste adecvate pentru a stabili siguranța MMG-ului.

Modificarea genetică nu ar trebui să crească stabilitatea MMG-ului față de cea a microorganismului nemodificat din mediu în cazul în care acest lucru ar avea afecte dăunătoare.

Deoarece orice instabilitate a modificării genetice ar putea compromite siguranța, trebuie să se dovedească stabilitatea. Aceasta în special în cazurile în care MMG-ul a făcut obiectul unei mutații inactivatoare pentru a atenua proprietăți dăunătoare.

MMG-ul nu ar trebui să poată provoca boli sau efecte dăunătoare asupra oamenilor sănătoși, animalelor sau plantelor sănătoase, în condiții normale de utilizare sau ca urmare a unui incident relativ previzibil, precum înțeparea cu un ac, ingestie accidentală, expunerea la un aerosol și diseminarea ce ar duce la o expunere a mediului. În cazul în care este tot mai probabil ca indivizi imunodeprimați să fie expuși la MMG, de exemplu, în cazul în care MMG-ul trebuie utilizat într-un mediu clinic, posibilele efecte ale acestei expuneri ar trebui luate în considerare pentru a evalua siguranța generală a MMG-ului.

Cercetările bibliografice și informațiile de bază colectate pentru examinarea criteriilor generale ar trebui să furnizeze marea parte a informațiilor necesare pentru evaluare. Ar trebui să se studieze datele referitoare la manipularea și siguranța speciei în cauză și a sușelor înrudite. Ar trebui, de asemenea, să se consulte liste de organisme patogene pentru om, animale sau plante.

Vectorii virali eucarioți, ce urmează să se includă în partea C din anexa II, nu ar trebui să producă efecte dăunătoare asupra sănătății oamenilor și mediului. Ar trebui să se cunoască originea lor, precum și mecanismul atenuării lor și stabilitatea caracteristicilor în cauză. Ar trebui să se confirme, pe cât posibil, prezența acestor caracteristici în virus, înainte de modificare și după realizarea acesteia. În cazul în care se utilizează asemenea vectori, este preferabil să se recurgă doar la mutații prin deleție. Se pot lua în considerare, de asemenea, construcțiile care utilizează vectori virali cu ADN sau ARN proveniți din celule de cultură gazdă în care nu s-a utilizat nici un virus infecțios sau susceptibil de a se produce.

Se poate considera că sușele nevirulente ale unei specii patogene recunoscute, ca vaccinurile vii pentru oameni și animale, nu prezintă riscuri sanitare și îndeplinesc prin urmare criteriile din partea B a anexei II, cu condiția ca:

În cazul în care un studiu bibliografic și taxonomic nu furnizează informațiile dorite, ar trebui să se efectueze teste de patogenicitate adecvate asupra microorganismului în cauză. Aceste teste ar trebui să se realizeze asupra MMG-ului, deși, în unele cazuri, ar putea fi oportun să se efectueze aceste teste asupra tulpinii receptoare sau parentale. Cu toate acestea, în cazul în care MMG-ul este foarte diferit de organismul (organismele) parental(e), ar trebui să se evite tragerea unor concluzii false cu privire la absența patogenicității.

Exemplele de tulpini receptoare sau parentale de microorganisme pentru producerea MMG-urilor ce pot fi considerate corespunzătoare pentru includerea în partea C din anexa II cuprind:

Vectorul și insertul, astfel cum apar în MMG-ul final, nu ar trebui să conțină gene care exprimă o proteină activă sau un transcript (de exemplu, factori de virulență, toxine etc.) la un nivel și într-o formă care conferă MMG-ului un fenotip susceptibil să provoace o boală la oameni, animale și plante sau să cauzeze efecte dăunătoare pentru mediu.

Este necesar să se evite utilizarea unui vector sau a unui insert ce conțin secvențe ce codează pentru caractere dăunătoare la anumite microorganisme, chiar dacă nu conferă MMG-ului un fenotip susceptibil să provoace o boală la oameni, animale și plante sau să cauzeze efecte dăunătoare asupra mediului. Trebuie, de asemenea, să se vegheze ca materialul genetic inserat să nu codeze pentru un determinant de patogenicitate capabil să se substituie unei mutații inactivatoare prezente în organismul parental.

Fenotipul ce rezultă dintr-un vector poate depinde de organismul receptor sau parental; ceea ce este valabil pentru o gazdă nu se poate aplica automat când construcția este transferată unei gazde diferite. De exemplu, un retrovirus inactivat utilizat ca vector în bacterii sau în majoritatea liniilor celulare ar fi incapabil să producă particule virale infecțioase. Cu toate acestea, același vector utilizat într-o linie celulară gazdă ar produce particule virale infecțioase și, în funcție de natura dezactivării și a secvențelor inserate, ar putea conferi MMG-ului un fenotip susceptibil să provoace o boală.

MMG-ul nu ar trebui să producă toxine nedorite sau o toxigenitate crescută în urma modificării genetice. Exotoxinele, endotoxinele și micotoxinele fac parte dintre toxinele bacteriene. Examinarea tulpinii receptoare sau parentale ar furniza informații utile în acest sens.

În cazul în care tulpina receptoare sau parentală este lipsită de toxine, trebuie să se vegheze ca vectorul/inserția să nu introducă toxine sau să nu stimuleze/dereprime producerea toxinelor. Prezența toxinelor ar trebui să se examineze cu atenție, deși nu conduce neapărat la excluderea MMG-ului din partea C a anexei II.

Pe când toate microorganismele sunt potențial alergene, anumite specii sunt alergeni recunoscuți, acestea din urmă putând fi găsite în Directiva 93/88/CEE a Consiliului (1) și Directiva 95/30/CE a Comisiei (2) și în versiunile lor modificate. Este necesar să se verifice dacă MMG-ul aparține acestui grup de alergeni. Componentele alergene ale microorganismelor pot cuprinde pereți celulari, spori, metaboliți naturali (de exemplu enzime proteolitice) și anumite antibiotice. În cazul în care vectorul și insertul se exprimă în MMG-ul final, produsul genetic nu trebuie să aibă activitate biologică care să poată produce alergeni semnificativi. Este de notat că acest criteriu nu se poate aplica în mod absolut.

MMG-ul nu ar trebui să conțină agenți adventivi cunoscuți, precum micoplasme, viruși, bacterii, ciuperci, alte celule vegetale sau animale, simbioți care pot produce efecte dăunătoare. O metodă de a evita acest risc este utilizarea unei tulpini receptoare sau parentale lipsite de agenți adventivi patogeni în construcția unui MMG. Cu toate acestea, nu trebuie să se pornească de la principiul că MMG-ul va fi lipsit de agenți adventivi deoarece organismul (organismele) parental(e) erau. S-ar fi putut introduce noi agenți în cursul construcției MMG-ului.

În special, este necesar să se verifice cu grijă dacă agenți adventivi potențial patogeni, precum virusul coriomeningitei limfocitare sau micoplasme ca Mycoplasma pneumoniae, sunt prezenți în culturile de celule animale. Agenții adventivi pot fi greu de detectat. Trebuie să se ia în considerare orice elemente ce ar reduce eficiența depistării.

Materialul genetic inserat în MMG nu ar trebui să fie transmisibil sau mobilizabil, în cazul în care ar putea cauza un fenotip dăunător într-un microorganism de tip parental.

Vectorul și inserția nu ar trebui să transfere nici un marker de rezistență MMG-ului, în cazul în care rezistența ar putea compromite tratamentul terapeutic. Prezența unor astfel de markeri nu ar exclude a priori înscrierea MMG-ului în partea C din anexa II, dar ar sublinia în plus că trebuie să se vegheze ca aceste gene să nu fie mobilizabile.

În cazul în care vectorul este un virus, un cosmid sau orice tip de vector derivat dintr-un virus, ar trebui să devină nelizogen când se folosește ca vector de clonare (de exemplu, lipsit de represorul cI-lambda). Inserția nu ar trebui să fie mobilizabilă, datorită, de exemplu, prezenței secvențelor de provirus transferabile sau a altor secvențe funcționale de transpoziție.

Unii vectori care sunt integrați în cromozomul gazdă pot, de asemenea, să fie considerați nemobilizabili, dar ar trebui studiați caz cu caz, în special, în ceea ce privește mecanismele ce pot facilita mobilitatea cromozomilor (de exemplu, prezența unui factor sexual cromozomial) sau transpoziția la alți repliconi ce pot fi prezenți în gazdă.

În mod normal, prejudiciile asupra mediului se produc doar în cazul în care un MMG poate supraviețui și prezintă caracteristici periculoase. În momentul evaluării prejudiciilor asupra mediului, trebuie să se ia în considerare condițiile de mediu diferite din statele membre și, după caz, să se preconizeze scenarii extreme. Dacă este cazul, ar trebui să se furnizeze de asemenea informații privind diseminările anterioare (deliberate sau nu), precum și impactul asociat asupra mediului.

Pentru a determina dacă un MMG este susceptibil de a cauza efecte dăunătoare asupra mediului sau de a provoca boli plantelor și animalelor, ar trebui să se cerceteze dacă caracteristicile biologice ale MMG-ului întăresc, mențin sau slăbesc capacitatea MMG-ului de a supraviețui în mediu. În cazul în care MMG-urile sunt incapabile din punct de vedere biologic de a supraviețui în mediu, aceste microorganisme nu vor supraviețui în afara recipientului pentru mult timp, astfel încât probabilitatea de interacțiune cu mediul este limitată.

În studiul eventualelor efecte dăunătoare asupra mediului, ar trebui să se ia în seamă, de asemenea, posibila evoluție a MMG-urilor care se diseminează din recipient în rețelele trofice.

Pentru a se putea implanta într-un mediu, un MMG ar trebui să supraviețuiască dispersării într-o nișă adecvată și să se instaleze în aceasta. Ar trebui să se ia în seamă metoda de dispersare și probabilitatea de supraviețuire în timpul dispersării. Numeroase microorganisme supraviețuiesc, de exemplu, în cazul în care sunt dispersate în aerosoli și picături, precum și via insecte și viermi.

Implantarea într-un anumit mediu depinde de natura mediului în care MMG-ul se diseminează și de capacitatea sa de a supraviețui transferului în noul mediu. Potențialul de implantare într-o nișă adecvată variază în funcție de mărimea populației viabile, mărimea nișei și frecvența nișelor adaptate speciei. Probabilitatea este diferită de la o specie la alta. În plus, rezistența sau sensibilitatea la factori de stres biotici sau abiotici va avea o mare influență asupra implantării unui MMG în mediu. Persistența unui MMG în mediu într-o perioadă destul de lungă este legată de capacitatea sa de a supraviețui și de a se adapta condițiilor de mediu sau de a dezvolta o rată de creștere competitivă. Acești factori ar putea fi influențați de modificarea genetică și de locul integrării. În anumite cazuri, este puțin probabil ca modificarea genetică să producă acest efect, mai ales când:

Tot mai multe informații sunt disponibile privind transferul de material genetic între microorganisme. Chiar dacă MMG-ul are o capacitate foarte limitată de a supraviețui, va fi important să se determine capacitatea materialului genetic introdus de a persista în mediu sau de a fi transferat la alte organisme și a cauza prejudicii. De exemplu, s-a demonstrat că transferul de material genetic survine în condiții experimentale în sol (incluzând rizosferele), în aparatul digestiv al animalelor și în apă, prin conjugare, transducție sau transformare.

Riscul de transfer de material genetic de la un MMG care are o probabilitate redusă de creștere și șanse de supraviețuire limitate este foarte scăzut. În cazul în care MMG-ul nu conține plasmide auto-transferabile sau bacteriofage transductoare, transferul activ este practic exclus. Riscul ar fi foarte redus în cazul în care vectorul/insertul nu este auto-transferabil și este slab mobilizabil.

Agenți adventivi— alte microorganisme, active sau latente, ce coexistă alături de micoorganismul dorit sau sunt prezente în interiorul acestuia.

Antigen— orice moleculă ce induce producerea de către limfocitele B a unui anticorp specific. O moleculă ce poate fi recunoscută în mod special de elementele adaptive ale sistemului imunitar, adică de limfocitele B sau T sau ambele.

Alergen— un antigen ce poate sensibiliza indivizii și poate provoca o reacție de hipersensibilitate la o expunere ulterioară la acest alergen.

Alergie— reacții de hipersensibilitate imediate, ce apar în cazul în care un răspuns imunitar al IgE la un antigen inofensiv, precum o celulă bacteriană nepatogenă sau neviabilă. Eliberarea unor mediatori farmacologici de către mastocitele sensibilizate de IgE produce o reacție inflamatorie acută cu simptome ca astm, eczemă sau rinită.

Cosmid— tip de vector de clonare ce cuprinde o plasmidă în care au fost inserate secvențele cos ale unui fag lambda.

Boală— orice perturbare structurală sau funcțională ce produce o afecțiune sau o tulburare la un om, un animal sau o plantă imunocompetent(ă).

Expresie— procesul de producere a transcripturilor ARN, proteinelor și polipeptidelor folosind informațiile conținute în genele MMG. În prezentul document, corespunde de asemenea nivelului de expresie anticipat sau cunoscut al materialului genetic inserat.

Insuficient mobilizabil— vectori la care le lipsesc una sau mai multe funcții de transfer și care nu sunt susceptibili de a fi mobilizați de alte elemente care furnizează funcțiile absente.

Patogenicitate— capacitatea microorganismului de a cauza o boală prin infecție, toxicitate sau alergenicitate. Patogenicitatea este un atribut taxonomic important propriu fiecărei specii.

Plasmidă— parte de ADN extracromozomial capabil de autoreplicare, descoperit la multe microorganisme, care conferă celulei gazdă un avantaj relativ pe planul evoluției.

Microorganism de tip parental— microorganism(e) la care s-a produs modificarea genetică.

Rizobacterie— bacterie care trăiește în rizosferă, și anume pământul ce aderă la rădăcinile plantelor, care penetrează în final rădăcinile la nivel intracelular sau intercelular. Rizobacteriile se utilizează deseori în agricultură ca inoculum bacterian sau pentru inocularea semințelor.

Transducție— încorporarea ADN-ului bacterian în particule de bacteriofage și transferul acestor particule la bacterii recipient.

Vector— o moleculă purtătoare de ADN sau ARN, de exemplu plasmidă, bacteriofag, în care se poate insera o secvență de material genetic care trebuie să se introducă într-o nouă celulă gazdă în care va fi replicată și, în anumite cazuri, exprimată.

Virulență— capacitatea de a dăuna. Capacitatea sușelor unor microorganisme de a dăuna celulelor gazdă poate varia considerabil de la o sușă la alta.