PRÍLOHA I

METÓDY ODBERU VZORIEK

1.   ÚČEL A ROZSAH

Vzorky určené na úradnú kontrolu krmív sa odoberajú v súlade s metódami opísanými nižšie. Takto získané vzorky sa považujú za reprezentatívne pre vzorkované partie.

2.   PRACOVNÍCI ODOBERAJÚCI VZORKY

Vzorky odoberajú pracovníci poverení členskými štátmi na tento účel.

3.   VYMEDZENIE POJMOV

Vzorkovaná partia: množstvo výrobku tvoriace celok a majúce charakteristické znaky, na základe ktorých sa predpokladá, že má homogénne zloženie.

Čiastková vzorka: množstvo odobraté z jedného miesta vzorkovanej partie.

Súhrnná vzorka: súhrn všetkých čiastkových vzoriek odobratých z tej istej vzorkovanej partie.

Zredukovaná vzorka: reprezentatívna časť súhrnnej vzorky získaná jej delením.

Konečná vzorka: časť zredukovanej vzorky alebo zhomogenizovanej súhrnnej vzorky.

4.   VZORKOVACIE POMÔCKY

4.1.	Pomôcky na odber vzoriek musia byť vyrobené z materiálov, ktoré nemôžu kontaminovať výrobky určené na odber vzoriek. Toto vybavenie môže byť úradne schválené členskými štátmi.

4.2.   Odporúčané vybavenie na odber vzoriek zo suchých krmív

4.2.1.   Ručný odber vzoriek

4.2.1.1.

Lopatka s plochým dnom a vertikálnymi stranami.

4.2.1.2.

Vzorkovacia tyč s dlhou dutinou alebo priehradkami. Rozmery vzorkovacej tyče musia byť primerané vlastnostiam vzorkovanej partie (hĺbka nádoby, rozmery vreca atď.) a veľkosti častíc krmív.

4.2.2.   Mechanický odber vzoriek

Schválené mechanické vybavenie sa môže používať na odber vzoriek z pohybujúceho sa krmiva.

4.2.3.   Delič vzorky

Vybavenie určené na rozdelenie vzorky na približne rovnaké časti sa môže použiť pri odbere čiastkových vzoriek a na prípravu zredukovanej a konečnej vzorky.

5.   KVANTITATÍVNE POŽIADAVKY

5.A.	V súvislosti s kontrolou látok alebo produktov rovnomerne rozložených v krmive
5.A.1.	Vzorkovaná partia Veľkosť vzorkovanej partie musí byť taká, aby v odobratej vzorke bola prítomná každá zložka krmiva.
5.A.2.	Čiastkové vzorky
5.A.2.1.	Voľne ložené krmivá:	Minimálny počet čiastkových vzoriek:
5.A.2.1.1.	Vzorkované partie, ktorých hmotnosť nepresahuje 2,5 metrických ton	Sedem
5.A.2.1.2.	Vzorkované partie, ktorých hmotnosť presahuje 2,5 metrických ton	√ 20 násobok počtu metrických ton, ktoré predstavujú vzorkovanú partiu (1), pričom najvyšší počet čiastkových vzoriek je 40
5.A.2.2.	Balené krmivá:	Minimálny počet balení, z ktorých sa má odobrať vzorka (2):
5.A.2.2.1.	Balenia s hmotnosťou viac ako jeden kilogram:
5.A.2.2.1.1.	Vzorkované partie s počtom jedno až štyri balenia	Všetky balenia
5.A.2.2.1.2.	Vzorkované partie s počtom päť až 16 balení	Štyri
5.A.2.2.1.3.	Vzorkované partie s počtom viac ako 16 balení	√ počet balení, ktoré predstavujú vzorkovanú partiu (1), pričom najvyšší počet balení je 20
5.A.2.2.2.	Balenia s hmotnosťou do 1 kg	Štyri
5.A.2.3.	Tekuté alebo polotekuté krmivá:	Minimálny počet nádob, z ktorých sa má odobrať vzorka (2):
5.A.2.3.1.	Nádoby s objemom viac ako jeden liter:
5.A.2.3.1.1.	Vzorkované partie s počtom jedna až štyri nádoby	Všetky nádoby
5.A.2.3.1.2.	Vzorkované partie s počtom päť až 16 nádob	Štyri
5.A.2.3.1.3.	Vzorkované partie s počtom viac ako 16 nádob	√ počet nádob, ktoré predstavujú vzorkovanú partiu (1), pričom najvyšší počet nádob je 20
5.A.2.3.2.	Nádoby s objemom nepresahujúcim jeden liter	Štyri
5.A.2.4.	Bloky krmiva a minerálne lizy	Minimálny počet blokov alebo lizov, z ktorých sa má odobrať vzorka (2): Jeden blok alebo jeden liz na vzorkovanú partiu s počtom 25 jednotiek, najviac však štyri bloky alebo štyri lizy
5.A.3.	Súhrnná vzorka Vyžaduje sa jedna súhrnná vzorka na vzorkovanú partiu. Celkové množstvo čiastkových vzoriek, ktoré tvorí súhrnnú vzorku, predstavuje najmenej:
5.A.3.1.	Voľne ložené krmivá	4 kg
5.A.3.2.	Balené krmivá:
5.A.3.2.1.	Balenia s hmotnosťou viac ako 1 kg	4 kg
5.A.3.2.2.	Balenia, ktorých hmotnosť nepresahuje 1 kg	Hmotnosť obsahu štyroch pôvodných balení
5.A.3.3.	Tekuté alebo polotekuté krmivá:
5.A.3.3.1.	Nádoby s objemom viac ako jeden liter	Štyri litre
5.A.3.3.2.	Nádoby, ktorých objem nepresahuje jeden liter	Objem obsahu štyroch pôvodných nádob
5.A.3.4.	Bloky krmiva a minerálne lizy:
5.A.3.4.1.	Každý s hmotnosťou viac ako 1 kg	4 kg
5.A.3.4.2.	Každý s hmotnosťou do 1 kg	Hmotnosť štyroch pôvodných blokov alebo lizov
5.A.4.	Konečné vzorky V prípade potreby sa konečné vzorky získajú redukciou súhrnnej vzorky. Vyžaduje sa analýza aspoň jednej konečnej vzorky. Množstvo konečnej vzorky na analýzu nie je menšie ako:
	Suché krmivá	500 g
	Tekuté alebo polotekuté krmivá	500 ml
5.B.	V súvislosti s kontrolou nežiaducich látok alebo produktov, ktoré by mohli byť nerovnomerne rozložené v krmive, napr. aflatoxínov, ražného námelu, ricínu a krotónu v kŕmnej surovine (3)
5.B.1.	Vzorkovaná partia: pozri 5.A.1.
5.B.2.	Čiastkové vzorky
5.B.2.1.	Voľne krmivá: pozri 5.A.2.1.
5.B.2.2.	Balené krmivá:	Minimálny počet balení, z ktorých sa majú odobrať vzorky:
5.B.2.2.1.	Vzorkované partie pozostávajúce z jedného až štyroch balení	Všetky balenia
5.B.2.2.2.	Vzorkované partie pozostávajúce z piatich až 16 balení	Štyri
5.B.2.2.3.	Vzorkované partie pozostávajúce z viac ako 16 balení	√ počet balení, ktoré predstavujú vzorkovanú partiu (1), pričom najvyšší počet balení je 40
5.B.3.	Súhrnné vzorky Počet súhrnných vzoriek závisí od veľkosti vzorkovanej partie. Minimálny počet súhrnných vzoriek na vzorkovanú partiu je uvedený nižšie. Celková hmotnosť čiastkových vzoriek, ktoré tvoria súhrnnú vzorku, predstavuje najmenej 4 kg na každú súhrnnú vzorku.
5.B.3.1.	Voľne ložené krmivá
	Hmotnosť vzorkovanej partie v metrických tonách:	Minimálny počet súhrnných vzoriek na vzorkovanú partiu:
	najviac 1	1
	viac ako 1 až do 10	2
	viac ako 10 až do 40	3
	nad 40	4
5.B.3.2.	Veľkosť vzorkovanej partie baleného krmiva vyjadrená počtom balení:	Minimálny počet súhrnných vzoriek na vzorkovanú partiu:
	1 až 16	1
	17 až 200	2
	201 až 800	3
	viac ako 800	4
5.B.4.	Konečné vzorky Z každej súhrnnej vzorky sa redukciou získavajú konečné vzorky. Vyžaduje sa analýza aspoň jednej konečnej vzorky na jednu súhrnnú vzorku. Hmotnosť konečnej vzorky na analýzu nesmie byť nižšia ako 500 g.

6.   POKYNY PRE ODBER, PRÍPRAVU A BALENIE VZORIEK

6.1.   Všeobecné pokyny

Vzorky sa musia odobrať a pripraviť čo najrýchlejšie s ohľadom na preventívne opatrenia, ktoré sú potrebné na zabezpečenie toho, aby nedošlo k zámene alebo ku kontaminácii produktu. Nástroje, ako aj plochy a nádoby určené na príjem vzoriek musia byť čisté a suché.

6.2.   Čiastkové vzorky

6.2.A.   V súvislosti s kontrolou látok alebo produktov rovnomerne rozložených v krmive

Čiastkové vzorky sa musia odobrať náhodne z celej vzorkovanej partie a musia mať približne rovnakú veľkosť.

6.2.A.1.   Voľne ložené krmivá

Vzorkovaná partia sa imaginárne rozdelí na určitý počet približne rovnakých častí. Počet častí zodpovedajúci počtu čiastkových vzoriek požadovanému v súlade s bodom 5.A.2 sa vyberá náhodne a z každej z týchto častí sa odoberá aspoň jedna vzorka.

V prípade potreby odber vzorky môže byť vykonaný počas pohybu vzorkovanej partie (nakladanie alebo vykladanie).

6.2.A.2.   Balené krmivo

Po výbere požadovaného množstva balení na odber vzoriek podľa bodu 5.A.2 sa časť obsahu každého balenia odoberá pomocou tyče alebo lopaty. V prípade potreby sa vzorky odoberú jednotlivo po vyprázdnení balení. Hrudky sa v každej súhrnnej vzorke rozbijú; v prípade potreby sa hrudky rozbijú oddelene a potom sa vrátia do vzorky.

6.2.A.3.   Homogénne alebo homogenizovateľné tekuté alebo polotekuté krmivá

Po výbere požadovaného počtu nádob na odber vzoriek podľa bodu 5.A.2 sa obsah v prípade potreby homogenizuje a z každej nádoby sa odoberie určité množstvo.

Čiastkové vzorky môžu byť odobraté počas vyprázdňovania obsahu nádoby.

6.2.A.4.   Nehomogenizovateľné, tekuté alebo polotekuté krmivá

Po výbere požadovaného počtu nádob na odber vzoriek podľa bodu 5.A.2 sa odoberú vzorky z rôznych vrstiev.

Vzorky môžu byť odobraté aj počas vyprázdňovania obsahu, ale prvé frakcie treba odstrániť.

V každom prípade celkový odobratý objem nesmie byť menší ako 10 litrov.

6.2.A.5.   Bloky krmiva a minerálne lizy

Po výbere požadovaného počtu blokov alebo lizov na odber vzoriek podľa bodu 5.A.2 sa odoberie časť z každého bloku alebo lizu.

6.2.B.   V súvislosti s kontrolou nežiaducich látok alebo produktov, ktoré by mohli byť nerovnomerne rozložené v krmive, napr. aflatoxínov, ražného námelu, ricínu a krotónu v kŕmnych surovinách.

Vzorkovaná partia sa imaginárne rozdelí na určitý počet približne rovnakých častí zodpovedajúci počtu súhrnných vzoriek uvedenému v bode 5.B.3. Ak tento počet je väčší než 1, celkový počet čiastkových vzoriek uvedený v bode 5.B.2 sa rozloží približne rovnako v jednotlivých častiach. Potom sa odoberú približne rovnako veľké vzorky (4) tak, aby celkové množstvo vo vzorkách z každej časti malo hmotnosť aspoň 4 kg požadovanú pre každú súhrnnú vzorku. Čiastkové vzorky odobraté z rozdielnych častí sa nespájajú.

6.3.   Príprava súhrnných vzoriek

6.3.A.   V súvislosti s kontrolou látok alebo produktov rovnomerne rozložených v krmive

Čiastkové vzorky sa zmiešajú tak, aby vytvorili jednu súhrnnú vzorku.

6.3.B.   V súvislosti s kontrolou nežiaducich látok alebo produktov, ktoré by mohli byť nerovnomerne rozložené v krmive, napr. aflatoxínov, ražného námelu, ricínu a krotónu v kŕmnych surovinách

Čiastkové vzorky z každej časti vzorkovanej partie sa zmiešajú a vytvoria sa súhrnné vzorky v počte podľa bodu 5.B.3, pričom sa starostlivo zaznamená pôvod každej súhrnnej vzorky.

6.4.   Príprava konečných vzoriek

Materiál v každej súhrnnej vzorke sa starostlivo premieša, čím sa získa homogenizovaná vzorka (5). V prípade potreby sa súhrnná vzorka vopred zredukuje na vzorku s hmotnosťou najmenej 2 kg alebo objemom najmenej 2 l pomocou mechanického alebo automatického deliča alebo metódou štvrtenia.

Takto sa pripravia aspoň tri konečné vzorky v približne rovnakom množstve, ktoré budú spĺňať kvantitatívne požiadavky bodu 5.A.4 alebo 5.B.4. Každá vzorka sa vloží do vhodnej nádoby. Urobia sa všetky potrebné opatrenia, aby sa zabránilo zmene zloženia vzorky, jej kontaminácii alebo znehodnoteniu, ktoré by mohlo vzniknúť počas prepravy alebo skladovania.

6.5.   Balenie konečných vzoriek

Nádoby alebo obaly sa pečatia a označujú (celé označenie musí byť neoddeliteľnou súčasťou pečatenia) tak, aby sa nedali otvoriť bez porušenia pečate.

7.   ZÁZNAM O ODBERE VZORKY

O každom odbere vzorky je potrebné viesť záznam, ktorý umožní jednoznačne rozoznať každú vzorkovanú partiu.

8.   MIESTO URČENIA VZORIEK

Za každú súhrnnú vzorku sa v najrýchlejšom možnom čase zašle oprávnenému laboratóriu na analýzu aspoň jedna konečná vzorka spolu s informáciami potrebnými pre analytika.

---

(1)  Ak je počet vyjadrený zlomkom, zaokrúhli sa na najbližšie vyššie celé číslo.

(2)  V prípade balení alebo nádob, ktorých obsah každého(-ej) nepresahuje 1 kilogram alebo 1 liter a v prípade blokov alebo lizov, z ktorých každý neváži viac ako 1 kg, čiastkovú vzorku tvorí obsah jedného pôvodného balenia alebo nádoby, jeden blok alebo jeden liz.

(3)  Metódy stanovené v bode 5.A sa uplatňujú na kontrolu aflatoxínov, ražného námelu, ricínu a krotónu v kompletnom alebo doplnkovom krmive.

(4)  Pri balených krmivách sa odstráni časť obsahu balení, z ktorých sa majú odobrať vzorky použitím tyče alebo lopaty po tom, ako sa v prípade potreby balenia jednotlivo vyprázdnia.

(5)  Hrudky sa pri každej súhrnnej vzorke rozbijú (v prípade potreby sa najskôr oddelia a neskôr vrátia k vzorke).

PRÍLOHA II

VŠEOBECNÉ USTANOVENIA TÝKAJÚCE SA ANALYTICKÝCH METÓD PRE KRMIVÁ

A.   PRÍPRAVA VZORIEK NA ANALÝZU

1.   Účel

Postupy opísané nižšie sa týkajú prípravy na analýzu konečných vzoriek zasielaných kontrolným laboratóriám po odobratí vzoriek v súlade s ustanoveniami stanovenými v prílohe I.

Tieto vzorky musia byť pripravené tak, aby navážené množstvá, ktoré sú uvedené v analytických metódach, boli homogénne a reprezentatívne konečné vzorky.

2.   Predbežné opatrenia

Postup prípravy vzorky, ktorý je potrebné dodržať, závisí od použitých analytických metód. Preto je mimoriadne dôležité zabezpečiť, aby bol tento postup prípravy vzorky primeraný použitej analytickej metóde.

Všetky potrebné kroky pracovného postupu sa musia vykonať takým spôsobom, aby sa v čo najvyššej možnej miere zamedzilo kontaminácii vzorky a zmenám jej zloženia.

Mletie, premiešanie a preosievanie by sa mali vykonať čo možno najrýchlejšie s minimálnym vystavením vzorky účinkom vzduchu a svetla. Nemali by sa používať mlynčeky a drviče, ktoré by mohli vzorky značne zahrievať.

Ručné mletie sa odporúča v prípade krmív obzvlášť citlivých na zohriatie. Malo by sa dbať aj na to, aby samotné prístrojové vybavenie nebolo zdrojom kontaminácie mikroprvkami.

Ak prípravu nemožno vykonať bez výrazných zmien v obsahu vlhkosti vzorky, je potrebné obsah vlhkosti určiť pred prípravou a po nej podľa metódy stanovenej v časti A prílohy III.

3.   Postup

Rozdeľte vzorku na niekoľko čiastkových vzoriek vhodných na analýzu a referenčné účely použitím vhodných techník delenia ako napr. striedavý odber lopatkou, stacionárne alebo krúživé deliace zariadenie. Delenia metódou kužeľov a štvrtenia sa neodporúčajú, keďže v ich dôsledku môžu vzniknúť dielčie vzorky s vysokou pravdepodobnosťou chyby z delenia. Vzorka sa uchová na referenčné účely vo vhodnej čistej a suchej nádobe so vzduchotesným uzáverom a pripravia sa z nej dielčie vzorky na analýzu s hmotnosťou najmenej 100 g spôsobom uvedeným nižšie.

3.1.   Krmivá, ktoré sa môžu priamo drviť

Pokiaľ nie je v analytických metódach ustanovené inak, po pomletí sa celá vzorka podľa potreby preoseje cez sito so štvorcovými okami so stranami 1 mm (v súlade s odporúčaním ISO R565). Vyhnite sa nadmerne jemnému pomletiu.

Preosiata vzorka sa premieša a vloží do vhodnej čistej, suchej nádoby so vzduchotesným uzáverom. Bezprostredne pred navažovaním množstva určeného na analýzu sa znovu premieša.

3.2.   Krmivá, ktoré sa môžu drviť po vysušení

Pokiaľ nie je v analytických metódach ustanovené inak, vzorka sa vysuší tak, aby sa jej vlhkosť znížila na 8 až 12 %, v súlade s postupom na predsušenie opísaným v bode 4.3 metódy na stanovenie vlhkosti uvedenej v časti A prílohy III. Ďalej sa postupuje podľa oddielu 3.1.

3.3.   Tekuté alebo polotekuté krmivá

Vzorka sa vloží do vhodnej čistej, suchej nádoby so vzduchotesným uzáverom. Bezprostredne pred navažovaním množstva určeného na analýzu sa dôkladne premieša.

3.4.   Iné krmivá

Vzorky, ktoré sa nedajú pripraviť v súlade s jedným z vyššie uvedených postupov, by sa mali upraviť akýmkoľvek iným postupom, ktorým sa zabezpečí, že množstvá navážené na analýzu budú homogénne a reprezentatívne konečné vzorky.

4.   Uskladnenie vzoriek

Vzorky sa musia skladovať pri teplote, ktorá nespôsobí zmeny v ich zložení. Vzorky určené na analýzu vitamínov alebo látok obzvlášť citlivých na svetlo by sa mali skladovať v nádobách z hnedého skla.

B.   USTANOVENIA TÝKAJÚCE SA CHEMIKÁLIÍ A PRÍSTROJOVÉHO VYBAVENIA POUŽÍVANÝCH PRI ANALYTICKÝCH METÓDACH

1.	Pokiaľ nie je v analytických metódach ustanovené inak, tak všetky chemikálie musia byť analyticky čisté (a.p.). Pri analýze mikroprvkov sa čistota chemikálií musí kontrolovať slepým pokusom. Na základe dosiahnutých výsledkov sa môže vyžadovať ďalšie prečistenie chemikálií.

2.

Akýkoľvek krok pracovného postupu zahŕňajúci prípravu roztokov, riedenie, preplachovanie alebo premývanie, uvedený v analytických metódach bez uvedenia použitého rozpúšťadla alebo riediacej kvapaliny znamená, že sa musí použiť voda. Všeobecne platí, že voda musí byť demineralizovaná alebo destilovaná. V konkrétnych prípadoch, ktoré sú uvedené v analytických metódach, sa musí osobitne prečistiť.

3.	Vzhľadom na zariadenie bežných kontrolných laboratórií sa pri analytických metódach uvádzajú len špeciálne nástroje a prístrojové vybavenie alebo také, ktoré vyžadujú osobitné používanie. Musia byť čisté, najmä vtedy, keď ide o stanovenie veľmi malých množstiev látok.

C.   POUŽITIE ANALYTICKÝCH METÓD A VYJADRENIE VÝSLEDKOV

1.   Postup pri extrakcii

Niektoré metódy si vyžadujú špecifické extrakčné postupy. Vo všeobecnosti platí, že iné postupy pri extrakcii ako ten, ktorý je uvedený v metóde, sa môžu uplatňovať len pod podmienkou, že sa dokáže, že tento použitý extrakčný postup má rovnakú extrakčnú účinnosť na analyzovanú matricu ako postup uvedený v metóde.

2.   Postup pri čistení

Niektoré metódy si vyžadujú špecifické postupy čistenia. Vo všeobecnosti platí, že iné postupy pri čistení ako ten, ktorý je uvedený v metóde, sa môžu uplatňovať len pod podmienkou, že sa dokáže, že tento použitý postup pri čistení má rovnaké analytické výsledky pre analyzovanú matricu ako postup uvedený v metóde.

3.   Správa o použitej metóde analýzy

Vo všeobecnosti je ustanovená jedna analytická metóda na stanovenie každej látky v krmive. Pokiaľ sa uvádza niekoľko metód, v správe o analýze musí byť uvedená metóda použitá v kontrolnom laboratóriu.

4.   Počet stanovení

Výsledky uvádzané v správe o analýze predstavujú priemernú hodnotu získanú najmenej z dvoch paralelných stanovení vykonaných z dvoch samostatných navážiek vzorky a musia sa vyznačovať uspokojivou opakovateľnosťou.

Avšak v prípade analýzy nežiaducich látok, ak je výsledok prvého stanovenia výrazne (> 50 %) nižší ako špecifikácia, ktorá sa má skontrolovať, nie sú potrebné žiadne ďalšie stanovenia, ak sa použijú vhodné postupy na určenie kvality.

V prípade kontroly deklarovaného obsahu látky alebo zložky, ak výsledok prvého stanovenia potvrdí deklarovaný obsah, t. j. ak analytický výsledok spadá do rozsahu prijateľnej odchýlky od deklarovaného obsahu, nie sú potrebné žiadne ďalšie stanovenia za podmienky, že sa použijú vhodné postupy na určenie kvality.

V niektorých prípadoch sa tento prijateľný rozsah odchýlky definuje v právnych predpisoch, ako napr. v smernici Rady 79/373/EHS (1).

5.   Správa o analytickom výsledku

Analytický výsledok sa vyjadruje spôsobom uvedeným v analytickej metóde na vhodný počet platných číslic a podľa potreby sa koriguje na obsah vlhkosti v konečnej vzorke pred prípravou.

6.   Neistota merania a miera návratnosti v prípade analýzy nežiaducich látok

Čo sa týka nežiaducich látok v zmysle smernice 2002/32/ES vrátane dioxínov a dioxínom podobných PCB, produkt určený ako krmivo pre zvieratá sa považuje za nevyhovujúci z hľadiska najvyššieho prípustného obsahu, ak sa na základe analytického výsledku najvyšší prípustný obsah pokladá za prekročený, pričom sa zohľadňuje rozšírená neistota merania a korekcia vzhľadom na návratnosť. Na posúdenie zhody sa používa analyzovaná koncentrácia upravená vzhľadom na návratnosť a po odpočítaní rozšírenej neistoty merania. Tento postup sa používa len v prípadoch, keď analytická metóda umožňuje odhad neistoty merania a korekcie vzhľadom na návratnosť (nie je možné ho použiť napr. v prípade mikroskopickej analýzy).

Správa o analytickom výsledku sa podáva takto (pokiaľ používaná analytická metóda umožňuje odhadnúť neistotu merania a mieru návratnosti):

a)	upravený vzhľadom na návratnosť s uvedením miery návratnosti. Úprava vzhľadom na návratnosť nie je potrebná v prípade, že miera návratnosti je v rozmedzí 90 – 110 %.

b)	ako „x +/– U“, kde x je analytický výsledok a U je rozšírená neistota merania, pomocou koeficientu pokrytia v hodnote 2, ktorý zabezpečuje približne 95-percentnú úroveň spoľahlivosti.

Ak je však výsledok analýzy výrazne nižší (> 50 %) ako špecifikácia, ktorá sa má skontrolovať, a za podmienky, že sa uplatňujú vhodné postupy na určenie kvality, a ak analýzy slúžia len na účely kontroly dodržania právnych ustanovení, môže sa podať správa o analytickom výsledku bez úpravy vzhľadom na návratnosť, a miera návratnosti, ako aj neistota merania sa v týchto prípadoch môžu zo správy vynechať.

---

(1)  Ú. v. ES L 86, 6.4.1979, s. 30.

PRÍLOHA III

ANALYTICKÉ METÓDY NA KONTROLU ZLOŽENIA KŔMNYCH SUROVÍN A KŔMNYCH ZMESÍ

A.   STANOVENIE VLHKOSTI

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie vlhkosti v krmivách. V prípade, že krmivo obsahuje prchavé látky, ako napr. organické kyseliny, treba si uvedomiť, že spolu s vlhkosťou sa stanoví aj značné množstvo prchavých látok.

Táto metóda sa nevzťahuje na analýzu mliečnych výrobkov ako kŕmnych surovín, analýzu minerálnych látok a zmesí zložených predovšetkým z minerálnych látok, analýzu živočíšnych a rastlinných tukov a olejov, ani na analýzu olejnatých semien a olejnatých plodov.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa vysuší za špecifikovaných podmienok, ktoré sa líšia podľa druhu krmiva. Úbytok hmotnosti sa stanoví vážením. V prípade krmív tuhého skupenstva, ktoré majú vysoký obsah vlhkosti, je potrebné ich predsušenie.

3.   Prístrojové vybavenie

3.1.

Mlynček z materiálu, ktorý neabsorbuje vlhkosť, ľahko sa čistí, umožňuje rýchle mletie bez vytvárania znateľného tepla, v najvyššej možnej miere zamedzuje kontaktu s okolitým vzduchom a spĺňa požiadavky uvedené nižšie v bodoch 4.1.1 a 4.1.2 (napr. kladivkové alebo vodou chladené mikromlynčeky, rozoberateľné kužeľové mlynčeky, nízkootáčkové mlynčeky alebo mlynčeky s ozubenými kolesami).

3.2.	Analytické váhy s presnosťou na 1 mg.

3.3.	Suché vysúšačky z nehrdzavejúceho kovu alebo skla s vrchnákmi zaručujúcimi vzduchotesné uzatvorenie; s pracovným povrchom, na ktorom je možné rozprestrieť skúšobnú vzorku vo vrstve približne 0,3 g/m2.

3.4.	Elektricky vyhrievaná izotermická sušiareň (± 2 oC), primerane vetraná, s možnosťou rýchlej regulácie teploty (1).

3.5.	Nastaviteľná elektricky vyhrievaná vákuová sušiareň vybavená olejovým čerpadlom a buď mechanizmom na vpúšťanie horúceho suchého vzduchu, alebo sušiacou látkou (napr. oxid vápenatý).

3.6.	Exsikátor s hrubou perforovanou kovovou alebo porcelánovou platňou obsahujúci účinnú sušiacu látku.

4.   Postup

Poznámka:

Postupy opísané v tomto oddiele sa musia vykonať ihneď po otvorení balení so vzorkami. Analýza sa musí vykonať aspoň dvakrát.

4.1.   Príprava

4.1.1.   Krmivá iné ako krmivá patriace pod body 4.1.2 a 4.1.3

Odoberte aspoň 50 g vzorky. Ak je potrebné, rozmeľte alebo rozdeľte ju takým spôsobom, aby sa zamedzilo akejkoľvek odchýlke v obsahu vlhkosti (pozri bod 6).

4.1.2.   Obilniny a obilné krúpy

Odoberte aspoň 50 g vzorky. Pomeľte na častice, z ktorých najmenej 50 % prejde sitom s veľkosťou ôk 0,5 mm, a zvyšok, ktorý zostane na site s okrúhlymi okami s veľkosťou 1 mm, bude najviac 10 %.

4.1.3.   Krmivá v tekutej alebo pastovitej forme, krmivá prevažne zložené z olejov a tukov

Odoberte približne 25 g vzorky, odvážte s presnosťou na 10 mg, pridajte primerané množstvo bezvodého piesku odváženého s presnosťou na 10 mg a miešajte, až kým sa nezíska homogénny produkt.

4.2.   Sušenie

4.2.1.   Krmivá iné ako krmivá patriace pod body 4.2.2 a 4.2.3

Odvážte vysúšačku (3.3) s vrchnákom s presnosťou na 1 mg. Do odváženej vysúšačky navážte približne 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg a rovnomerne rozložte. Vložte vysúšačku bez vrchnáka do sušiarne predhriatej na teplotu 103 oC. Aby ste sa vyhli neželanému poklesu teploty sušiarne, vysúšačku do nej vložte čo najrýchlejšie. Vzorka sa suší štyri hodiny, ktoré sa počítajú od času, keď sa teplota v sušiarni vráti na 103 oC. Na vysúšačku položte vrchnák, vyberte ju z pece, nechajte ju v exsikátore (3.6) počas 30 až 45 minút vychladnúť a odvážte s presnosťou na 1 mg.

Krmivá zložené prevažne z olejov a tukov sušte v sušiarni ešte ďalších 30 minút pri teplote 130 oC. Rozdiel medzi dvomi váženiami nesmie presiahnuť 0,1 % vlhkosti.

4.2.2.   Obilniny, múka, krúpy a šrot

Odvážte vysúšačku (3.3) s vrchnákom s presnosťou na 0,5 mg. Do odváženej vysúšačky navážte približne 5 g rozdrvenej vzorky s presnosťou na 1 mg a rovnomerne rozložte. Vložte vysúšačku bez vrchnáka do sušiarne predhriatej na teplotu 130 oC. Aby ste sa vyhli neželanému poklesu teploty sušiarne, vysúšačku do nej vložte čo najrýchlejšie. Vzorku nechajte sušiť dve hodiny, ktoré sa počítajú od času, keď sa teplota v sušiarni vráti na 130 oC. Na vysúšačku položte vrchnák, vyberte ju z pece, nechajte ju v exsikátore (3.6) za 30 až 45 minút vychladnúť a odvážte s presnosťou na 1 mg.

4.2.3.

Kŕmna zmes obsahujúca viac ako 4 % sacharózy alebo laktózy: kŕmne suroviny ako napr. svätojánsky chlieb, hydrolyzované obilninové produkty, slad, sušené repné rezky, šťavy z rýb a cukru; kŕmne zmesi obsahujúce viac ako 25 % minerálnych solí vrátane vody z kryštalizácie. Odvážte vysúšačku (3.3) s vrchnákom s presnosťou na 0,5 mg. Do odváženej vysúšačky navážte približne 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg a rovnomerne rozložte. Vysúšačku bez vrchnáka vložte do vákuovej sušiarne (3.5) predhriatej na teplotu medzi 80 oC a 85 oC. Aby ste sa vyhli neželanému poklesu teploty sušiarne, nádobu do nej vložte čo najrýchlejšie. Nastavte tlak na 100 torrov a nechajte pri tomto tlaku sušiť štyri hodiny, buď pod prúdom horúceho suchého vzduchu alebo použite sušiaci prostriedok (približne 300 g na 20 vzoriek). V prípade použitia sušiacej látky odpojte vákuové čerpadlo po dosiahnutí predpísaného tlaku. Čas sušenia počítajte od momentu, keď sa teplota v sušiarni vráti na hodnotu od 80 oC do 85 oC. Opatrne upravte atmosférický tlak v sušiarni na pôvodnú hodnotu. Potom ju otvorte, ihneď na vysúšačku položte vrchnák, vyberte ju zo sušiarne, nechajte v exsikátore (3.6) za 30 až 45 minút vychladnúť a odvážte s presnosťou na 1 mg. Sušte ďalších 30 minút vo vákuovej sušiarni pri teplote od 80 oC to 85 oC a opäť odvážte. Rozdiel medzi dvomi váženiami nesmie presiahnuť 0,1 % vlhkosti.

4.3.   Predsušenie

4.3.1.   Krmivá iné ako krmivá patriace pod bod 4.3.2

Krmivá tuhého skupenstva s vysokým obsahom vlhkosti, ktoré spôsobujú problémy pri mletí, sa musia predsušiť podľa nasledujúceho postupu:

Navážte 50 g nerozdrvenej vzorky s presnosťou na 10 mg (lisované alebo zhrudkované krmivá sa môžu v prípade potreby rozdrviť nahrubo) vo vhodnej vysúšačke (napr. hliníková platňa s veľkosťou 20 × 12 cm s 0,5 cm rámom). Nechajte sušiť v sušiarni pri teplote od 60 oC to 70 oC, až kým sa vlhkosť nezníži na 8 % až 12 %. Vytiahnite zo sušiarne, nechajte v laboratóriu nezakrytú po dobu 1 hodiny vychladnúť a odvážte s presnosťou na 10 mg. Vzorku ihneď rozdrvte podľa bodu 4.1.1 a vysušte podľa bodu 4.2.1 alebo 4.2.3 podľa druhu krmiva.

4.3.2.   Obilniny

Obilné zrná s obsahom vlhkosti vyšším ako 17 % sa musia predsušiť, a to nasledujúcim postupom:

Navážte 50 g nerozdrvených zŕn s presnosťou na 10 mg vo vhodnej vysúšačke (napr. hliníková platňa s veľkosťou 20 × 12 cm s 0,5 cm rámom). Nechajte v sušiarni 5 až 7 minút sušiť pri teplote 130 oC. Vytiahnite zo sušiarne, nechajte v laboratóriu nezakrytú po dobu 2 hodín vychladnúť a odvážte s presnosťou na 10 mg. Vzorku ihneď rozdrvte podľa bodu 4.1.2 a vysušte podľa bodu 4.2.2.

5.   Výpočet výsledkov

Obsah vlhkosti (X), ako percento zo vzorky sa vypočíta podľa tejto rovnice:

5.1.   Sušenie bez predsušenia

kde:

m	=	počiatočná hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch,
m0	=	hmotnosť vysušenej skúšobnej vzorky v gramoch.

5.2.   Sušenie s predsušením

kde:

m	=	počiatočná hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch,
m1	=	hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch po predsušení,
m2	=	hmotnosť skúšobnej vzorky po rozdrvení alebo pomletí v gramoch,
m0	=	hmotnosť vysušenej skúšobnej vzorky v gramoch.

5.3.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,2 % absolútnej hodnoty vlhkosti.

6.   Poznámky

Ak vzorku treba upraviť drvením a ak sa zdá, že táto úprava zmení obsah vlhkosti produktu, výsledky analýzy zložiek krmív sa musia upraviť na základe obsahu vlhkosti vzorky v jej pôvodnom stave.

B.   STANOVENIE VLHKOSTI V ŽIVOČÍŠNYCH A RASTLINNÝCH TUKOCH A OLEJOCH

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah vody a prchavých látok v živočíšnych a rastlinných tukoch a olejoch.

2.   Podstata metódy

Vzorka je vysušená na konštantnú hmotnosť (úbytok hmotnosti medzi dvoma za sebou nasledujúcimi váženiami musí byť ≤ 1 mg) pri teplote 103 oC. Úbytok hmotnosti sa stanoví vážením.

3.   Prístrojové vybavenie

3.1.	Miska s plochým dnom z nehrdzavejúceho materiálu s priemerom 8 až 9 cm a výškou približne 3 cm.

3.2.	Teplomer so spevnenou guľôčkou a s vyrovnávacou rúrkou na hornom konci, s delenou stupnicou od približne 80 oC do najmenej 110 oC a s dĺžkou približne 10 cm.

3.3.	Pieskový kúpeľ alebo elektrická vyhrievacia platňa.

3.4.	Exsikátor obsahujúci účinnú sušiacu látku.

3.5.	Analytické váhy.

4.   Postup

Navážte s presnosťou na 1 mg približne 20 g zhomogenizovanej vzorky do suchej odváženej misky (3.1), v ktorej sa nachádza teplomer (3.2). Zohrejte na pieskovom kúpeli alebo vyhrievacej platni (3.3), za trvalého miešania teplomerom tak, aby teplota dosiahla hodnotu 90 oC za približne 7 minút.

Znížte intenzitu ohrevu pozorujúc frekvenciu akou stúpajú bubliny z dna misky. Teplota nesmie presiahnuť hodnotu 105 oC. Pokračujte v miešaní, stierajúc dno misky, kým sa neprestanú tvoriť bubliny.

S cieľom zabezpečiť úplné odstránenie vlhkosti niekoľkokrát znovu zohrejte na teplotu 103 oC ± 2 oC, pričom medzi jednotlivými zohriatiami ochlaďte na 93 oC. Potom nechajte vychladnúť na laboratórnu teplotu v exsikátore (3.4) a odvážte. Túto operáciu opakujte dovtedy, kým úbytok hmotnosti medzi dvomi za sebou nasledujúcimi váženiami nebude menší ako 2 mg.

Poznámka:

Nárast hmotnosti vzorky po opakovanom zohriatí znamená oxidáciu tuku, v takomto prípade vypočítajte výsledok z váženia vykonaného bezprostredne pred tým, ako začala hmotnosť stúpať.

5.   Výpočet výsledkov

Obsah vlhkosti (X), ako percento vzorky, je daný nasledujúcim vzorcom:

kde:

m	=	počiatočná hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch,
m1	=	hmotnosť misky v gramoch s obsahom pred zohrievaním,
m2	=	hmotnosť misky v gramoch s obsahom po zohriatí.

Výsledky menšie ako 0,05 % sa musia vyjadriť ako „menej ako 0,05 %“.

Opakovateľnosť

Rozdiel vo vlhkosti medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,05 % v absolútnej hodnote.

C.   STANOVENIE OBSAHU DUSÍKATÝCH LÁTOK

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah dusíkatých látok na základe obsahu dusíka stanoveného podľa Kjeldahlovej metódy.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa mineralizuje kyselinou sírovou v prítomnosti katalyzátora. Kyslý roztok sa zalkalizuje roztokom hydroxidu sodného. Amoniak sa oddestiluje a zachytí v odmeranom množstve kyseliny sírovej, ktorej prebytok sa titruje štandardným roztokom hydroxidu sodného.

Uvoľnený amoniak sa eventuálne oddestiluje do prebytku roztoku kyseliny boritej, po čom nasleduje titrácia roztokom kyseliny chlorovodíkovej alebo kyseliny sírovej.

3.   Chemikálie

3.1.	Síran draselný.

3.2.	Katalyzátor: oxid meďnatý (II) CuO alebo pentahydrát síranu meďnatého (II), CuSO4 5H2 O.

3.3.	Granulovaný zinok.

3.4.	Kyselina sírová, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5.	Kyselina sírová, štandardný odmerný roztok, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6.	Kyselina sírová, štandardný odmerný roztok, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7.	Kyselina sírová, štandardný odmerný roztok, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8.	Indikátor metylčerveň; rozpustite 300 mg metylčervene v 100 ml etanolu, σ = 95 – 96 % (v/v).

3.9.	Roztok hydroxidu sodného (môže sa použiť technicky čistý) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10.

Hydroxid sodný, štandardný odmerný roztok, c (NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.

Hydroxid sodný, štandardný odmerný roztok, c (NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12.

Granulovaná pemza premytá kyselinou chlorovodíkovou a vyžíhaná.

3.13.

Acetanilid (b.t. = 114 oC, N-obsah = 10,36 %).

3.14.

Sacharóza (bez dusíka).

3.15.

Kyselina boritá (H3BO3).

3.16.

Indikátorový roztok metylčervene: rozpustite 100 mg metylčervene v 100 ml etanolu alebo metanolu.

3.17.

Roztok bromkrezolovej zelene: rozpustite 100 mg bromkrezolovej zelene v 100 ml etanolu alebo metanolu.

3.18.

Roztok kyseliny boritej (10 g/l až 40 g/l v závislosti od použitého prístrojového vybavenia) Ak sa použije kolorimetrická detekcia bodu ekvivalencie, do roztokov kyseliny boritej sa musia pridať indikátory metylčerveň a bromkrezol. Ak sa pripravuje 1 liter kyseliny boritej, pred úpravou objemu sa pridá 7 ml indikátorového roztoku metylčervene (3.16) a 10 ml roztoku bromkrezolovej zelene (3.17). V závislosti od použitej vody sa môže pH jednotlivých roztokov kyseliny boritej líšiť. Často je potrebná úprava pomocou malého objemu zásaditej látky tak, aby sme získali vhodné pH. Poznámka: Pridanie cca 3 až 4 ml NaOH (3.11) do 1 litra 10 g/l kyseliny boritej je zvyčajne dobrou metódou úpravy. Roztok skladujte pri izbovej teplote a počas skladovania ho chráňte pred svetlom a zdrojom amoniakových výparov.

3.19	Štandardný odmerný roztok kyseliny chlorovodíkovej c(HCL) = 0,10 mol/l. Poznámka: Možno použiť aj iné koncentrácie odmerných roztokov (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 a 3.19), ak sa to zohľadní pri výpočtoch. Koncentrácie by sa vždy mali vyjadriť s presnosťou na štyri desatinné miesta.

4.   Prístrojové vybavenie

Prístrojové vybavenie je vhodné na vykonanie mineralizácie, destilácie a titrácie podľa Kjeldahlovej metódy.

5.   Postup

5.1.   Mineralizácia

Navážte 1 g vzorky s presnosťou na 0,001 g a vzorku preneste do mineralizačnej banky. Pridajte 15 g síranu draselného (3.1), vhodné množstvo katalyzátora (3.2) [0,3 až 0,4 g oxidu meďnatého (II) alebo 0,9 až 1,2 g pentahydrátu síranu meďnatého (II)], 25 ml kyseliny sírovej (3.4) a v prípade potreby niekoľko granúl pemzy (3.12) a premiešajte.

Banku najskôr mierne zahrievajte, ak je potrebné, obsah občas premiešajte, až kým hmota zuhoľnatie a kým sa prestane tvoriť pena; potom zahrievajte intenzívnejšie, až kým kvapalina nedosiahne trvalý var. Zahrievanie je primerané vtedy, keď vriaca kyselina kondenzuje na stenách banky. Zabráňte prehriatiu stien banky a zachytávaniu organických častíc na nich.

Keď sa roztok vyčíri a získa svetlozelenú farbu, pokračujte vo vare ešte ďalšie dve hodiny, potom nechajte vychladnúť.

5.2.   Destilácia

Opatrne pridajte dostatočné množstvo vody, aby sa sírany úplne rozpustili. Nechajte vychladnúť a potom v prípade potreby pridajte niekoľko granúl zinku (3.3). Postupujte podľa bodov 5.2.1 alebo 5.2.2.

5.2.1.   Destilácia do kyseliny sírovej

Do zachytávacej banky destilačného prístroja dajte presne odmerané množstvo 25 ml kyseliny sírovej (3.5) alebo (3.7) v závislosti od predpokladaného obsahu dusíka. Pridajte niekoľko kvapiek indikátora metylčervene (3.8).

Pripojte mineralizačnú banku na chladič destilačného prístroja a ponorte koniec chladiča do kvapaliny nachádzajúcej sa v zachytávacej banke do hĺbky najmenej 1 cm (pozri poznámku 8.3). Pomaly nalejte 100 ml roztoku hydroxidu sodného (3.9) do mineralizačnej banky bez straty amoniaku (pozri poznámku 8.1). Banku zahrievajte až do úplného predestilovania amoniaku.

5.2.2.   Destilácia do kyseliny boritej

V prípade manuálnej titrácie amoniakového obsahu destilátu sa uplatňuje nižšie opísaný postup. V prípade, že destilačná jednotka je plne automatizovaná a zahŕňa titráciu amoniakového obsahu destilátu, dodržiavajte pokyny pre prevádzku destilačnej jednotky.

Umiestnite zachytávaciu banku s obsahom 25 až 30 ml roztoku kyseliny boritej (3.18) pod otvor chladiča tak, že vývod chladiča je ponorená pod hladinu roztoku kyseliny boritej, ktorá je v prebytku. Prispôsobte destilačnú jednotku na dávkovanie 50 ml roztoku hydroxidu sodného (3.9). S destilačnou jednotkou pracujte podľa pokynov výrobcu a destilujte amoniak uvoľnený pridaním roztoku hydroxidu sodného. Zachytávajte destilát do zachytávacieho roztoku kyseliny boritej. Množstvo destilátu (doba parnej destilácie) závisí od množstva dusíka vo vzorke. Dodržujte pokyny výrobcu.

Poznámka:

V poloautomatickej destilačnej jednotke sa dopĺňanie zvyšného hydroxidu sodného a parná destilácia vykonávajú automaticky.

5.3.   Titrácia

Postupujte podľa bodu 5.3.1 alebo 5.3.2.

5.3.1.   Kyselina sírová

Titrujte prebytočnú kyselinu sírovú v zachytávacej banke s roztokom hydroxidu sodného (3.10 alebo 3.11) v závislosti od koncentrácie použitej kyseliny sírovej až do dosiahnutia bodu ekvivalencie.

5.3.2.   Kyselina boritá

Titrujte obsah zachytávacej banky so štandardným odmerným roztokom kyseliny chlorovodíkovej (3.19) alebo štandardným odmerným roztokom kyseliny sírovej (3.6) použitím byrety a prečítajte množstvo použitého titračného roztoku.

Ak sa použije kolorimetrická detekcia bodu ekvivalencie, bod ekvivalencie sa dosiahne pri prvom sfarbení obsahu na ružovo. Odčítajte objem byrety s presnosťou na 0,05 ml. Bod ekvivalencie možno lepšie vidieť, ak sa použije osvietená magnetická platňa na miešanie alebo fotometrický detektor.

Tento postup možno vykonať automaticky použitím parného destilátora s automatickou titráciou.

Pri prevádzke špecifického destilátora alebo destilátora/titrátora dodržiavajte pokyny výrobcu.

Poznámka:

Pri použití automatického titračného systému sa titrácia začína hneď po začatí destilácie a použije sa 1 % roztok kyseliny boritej (3.18). Pri použití plne automatickej destilačnej jednotky sa automatická titrácia amoniaku môže vykonať aj pomocou detekcie bodu ekvivalencie použitím potenciometrického pH systému. V tomto prípade sa použije automatický titrátor s pH-metrom. Tento pH-meter má byť správne nakalibrovaný v rozsahu pH od 4 do 7 podľa bežných laboratórnych postupov týkajúcich sa kalibrácie pH. Bod ekvivalencie titrácie pH sa dosiahne pri hodnote pH 4,6, pričom ide o bod obratu na titračnej krivke (inflexný bod).

5.4.   Slepý pokus

Vykonajte slepý pokus, ktorým sa potvrdí, že chemikálie neobsahujú dusík (mineralizáciou, destiláciou a titráciou), s použitím 1 g sacharózy (3.14) namiesto vzorky.

6.   Výpočet výsledkov

Výpočty sa robia podľa bodu 6.1 alebo 6.2.

6.1.   Výpočet pri titrácii podľa bodu 5.3.1

Obsah dusíkatých látok vyjadrený ako percentuálny podiel hmotnosti sa vypočíta podľa tohto vzorca:

kde:

V0	=	objem (ml) NaOH (3.10 alebo 3.11) použitého pri slepom pokuse,
V1	=	objem (ml) NaOH (3.10 alebo 3.11) použitého pri titrácii vzorky,
c	=	koncentrácia (mol/l) hydroxidu sodného (3.10 alebo 3.11),
m	=	hmotnosť (g) vzorky.

6.2.   Výpočet pri titrácii podľa bodu 5.3.2

6.2.1.   Titrácia s kyselinou chlorovodíkovou

Obsah dusíkatých látok vyjadrený ako percentuálny podiel hmotnosti sa vypočíta podľa tohto vzorca:

kde:

m	=	hmotnosť (g) skúšobnej vzorky,
c	=	koncentrácia (mol/l) štandardného odmerného roztoku kyseliny chlorovodíkovej (3.19),
V0	=	objem (ml) kyseliny chlorovodíkovej použitej pri slepom pokuse,
V1	=	objem (ml) kyseliny chlorovodíkovej použitej na skúšobnú vzorku.

6.2.2.   Titrácia s kyselinou sírovou

Obsah dusíkatých látok vyjadrený ako percentuálny podiel hmotnosti sa vypočíta podľa tohto vzorca:

kde:

m	=	hmotnosť (g) skúšobnej vzorky,
c	=	koncentrácia (mol/l) štandardného odmerného roztoku kyseliny sírovej (3.6),
V0	=	objem (ml) kyseliny sírovej (3.6) použitej pri slepom pokuse,
V1	=	objem (ml) kyseliny sírovej (3.6) použitej na skúšobnú vzorku.

7.   Overenie metódy

7.1.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

—	0,2 % v absolútnej hodnote pre obsah dusíkatých látok nižší ako 20 %,

—	1,0 % relatívnych z vyššej hodnoty pre obsah dusíkatých látok od 20 % do 40 %,

—	0,4 % v absolútnej hodnote pre obsah dusíkatých látok vyšší ako 40 %.

7.2.   Správnosť

Vykonajte analýzu (mineralizáciu, destiláciu a titráciu) na 1,5 až 2,0 g acetanilidu (3.13) v prítomnosti 1 g sacharózy (3.14); na 1 g acetanilidu sa spotrebuje 14,80 ml kyseliny sírovej (3.5). Návratnosť musí byť aspoň 99 %.

8.   Poznámky

8.1.

Prístrojové vybavenie môže byť manuálne, poloautomatické a automatické. Ak si vybavenie vyžaduje prenos medzi krokom mineralizácie a destilácie, musí sa vykonať bez toho, aby došlo k stratám. Ak zachytávacia banka destilačného prístroja nie je vybavená prikvapkávacím lievikom, pridajte bezprostredne pred jej pripojením na chladič hydroxid sodný pomalým prilievaním kvapaliny po stene banky.

8.2.	Ak zmineralizovaná látka stuhne, zopakujte stanovenie s použitím väčšieho množstva kyseliny sírovej (3.4) ako je množstvo uvedené vyššie.

8.3.	Pri produktoch s nižším obsahom dusíka možno v prípade potreby objem kyseliny sírovej (3.7) pridávanej do zachytávacej banky znížiť na 10 alebo 15 ml a doplniť vodou na 25 ml.

8.4.

Pri rutinnej analýze sa na stanovenie dusíkatých látok môžu použiť alternatívne metódy, no referenčnou metódou je Kjeldahlova metóda opísaná v časti C. Ekvivalencia výsledkov získaných alternatívnou metódou (napr. DUMAS) v porovnaní s referenčnou metódou sa musí dokázať samostatne pri každej matrici. Keďže výsledky získané alternatívnou metódou sa môžu aj v prípade overenia ekvivalencie nepatrne odchyľovať od výsledkov získaných referenčnou metódou, je potrebné v správe o analýze uviesť metódu analýzy použitú pri stanovení dusíkatých látok.

D.   STANOVENIE MOČOVINY

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie obsahu močoviny v krmivách.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa rozmieša vo vode s číriacim činidlom. Suspenzia sa prefiltruje. Obsah močoviny vo filtráte sa stanovuje po pridaní 4-dimetylaminobenzaldehydu (4-DMAB) zmeraním absorbancie pri vlnovej dĺžke 420 nm.

3.   Chemikálie

3.1.	Roztok 4-dimetylaminobenzaldehydu: rozpustite 1,6 g 4-DMAB v 100 ml 96 % etanolu a pridajte 10 ml kyseliny chlorovodíkovej (ρ201,19 g/ml). Túto chemikáliu možno uchovávať maximálne dva týždne.

3.2.	Carrezovo činidlo I: Rozpustite vo vode 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého, Zn(CH3COO)2 2H2O a 3 g ľadovej kyseliny octovej. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.3.	Carrezovo činidlo II: Rozpustite vo vode 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného, K4 Fe (CN)6 3H2O. Doplňte vodou na objem 100 ml.

3.4.	Aktívne uhlie, ktoré neabsorbuje močovinu (je potrebné skontrolovať).

3.5.	Močovina, 0,1 % roztok (w/v).

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Mixér (trepačka): Približne 35 až 40 ot/min.

4.2.	Skúmavky: 160 × 16 mm so zábrusovými zátkami.

4.3.	Spektrofotometer.

5.   Postup

5.1.   Analýza vzorky

Navážte 2 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte spolu s 1 g aktívneho uhlia (3.4) do 500 ml odmernej banky. Pridajte 400 ml vody a 5 ml Carrezovho činidla I (3.2), miešajte približne 30 sekúnd a pridajte 5 ml Carrezovho činidla II (3.3). Miešajte 30 minút v trepačke. Doplňte objem vodou, potrepte a prefiltrujte.

Odoberte 5 ml z číreho bezfarebného filtrátu do skúmaviek so zábrusovými zátkami, pridajte 5 ml roztoku 4-DMAB (3.1) a premiešajte. Skúmavky umiestnite do vodného kúpeľa s teplotou 20 oC (+/– 4 oC). Po pätnástich minútach zmerajte absorbanciu roztoku vzorky pomocou spektrofotometra pri 420 nm. Porovnajte so slepým pokusom z použitých chemikálií.

5.2.   Kalibračná krivka

Odoberte objemy 1, 2, 4, 5 a 10 ml z roztoku močoviny (3.5), vložte každý do jednej 100 ml odmernej banky a doplňte objem vodou. Odoberte z každého roztoku 5 ml, pridajte do každého 5 ml roztoku 4-DMAB (3.1), zhomogenizujte a zmerajte absorbanciu podľa vyššie uvedeného postupu porovnaním s kontrolným roztokom obsahujúcim 5 ml 4-DMAB a 5 ml vody bez močoviny. Zakreslite kalibračnú krivku.

6.   Výpočet výsledkov

Množstvo močoviny vo vzorke sa stanoví pomocou kalibračnej krivky.

Výsledok sa vyjadrí ako percento zo vzorky.

7.   Poznámky

7.1.	V prípade, že obsah močoviny presahuje 3 %, zredukujte vzorku na 1 g alebo rozrieďte pôvodný roztok tak, aby v 500 ml nebolo viac ako 50 mg močoviny.

7.2.	V prípade nízkeho obsahu močoviny vzorku zväčšite až dovtedy, kým filtrát zostane číry a bezfarebný.

7.3.	Ak vzorka obsahuje dusíkaté zlúčeniny, ako sú aminokyseliny, absorbanciu treba merať pri 435 nm.

E.   STANOVENIE PRCHAVÝCH DUSÍKATÝCH LÁTOK

I.   MIKRODIFÚZIOU

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah prchavých dusíkatých látok v krmivách vyjadrených ako amoniak.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa extrahuje s vodou a roztok sa vyčíri a prefiltruje. Prchavé dusíkaté látky sú vytesnené mikrodifúziou s použitím roztoku uhličitanu draselného, zachytené v roztoku kyseliny boritej a titrované kyselinou sírovou.

3.   Chemikálie

3.1.	Kyselina trichlóroctová, roztok 20 % (w/v).

3.2.	Indikátor: Rozpustite 33 mg bromkrezolovej zelene a 65 mg metylčervene v 100 ml 95 % – 96 % (v/v) etanolu.

3.3.

Roztok kyseliny boritej: v odmernej banke s objemom 1 liter rozpustite 10 g kyseliny boritej v 200 ml 95 % – 96 % (v/v) etanolu a 700 ml vody. Pridajte 10 ml indikátora (3.2). Premiešajte a v prípade potreby upravte farbu roztoku na bledočervenú pridaním roztoku hydroxidu sodného. V 1 ml tohto roztoku sa zachytí najviac 300 μg NH3.

3.4.	Nasýtený roztok uhličitanu draselného: Rozpustite 100 g uhličitanu draselného v 100 ml vriacej vody. Nechajte vychladnúť a prefiltrujte.

3.5.	Kyselina sírová, 0,01 mol/liter.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Mixér (trepačka): približne 35 až 40 ot/min.

4.2.	Sklenené alebo plastové Conwayove misky (pozri diagram).

4.3.	Mikrobyrety delené na 1/100 ml.

5.   Postup

Navážte 10 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte ju so 100 ml vody do odmernej banky s objemom 200 ml. Mixujte alebo miešajte 30 minút v trepačke. Pridajte 50 ml roztoku kyseliny trichlóroctovej (3.1), doplňte vodou na celkový objem, rázne potrepte a prefiltrujte cez skladaný filter.

Použitím pipety dajte 1 ml roztoku kyseliny boritej (3.3) do stredu Conwayovej misky a 1 ml filtrátu vzorky do medzikružia misky. Čiastočne prikryte vazelínou natretým vrchnákom. Rýchlo prikvapnite 1 ml nasýteného roztoku uhličitanu draselného (3.4) do medzikružia misky a vzduchotesne uzatvorte vrchnákom. Opatrne otáčajte misku v horizontálnej polohe tak, aby sa zmiešali obe chemikálie. Nechajte inkubovať aspoň štyri hodiny pri laboratórnej teplote alebo hodinu pri teplote 40 oC.

Použitím mikrobyrety (4.3) titrujte prchavé látky v roztoku kyseliny boritej s kyselinou sírovou (3.5).

Urobte slepý pokus podľa toho istého postupu, no bez vzorky, ktorá sa má analyzovať.

6.   Výpočet výsledkov

1 ml H2SO40,01 mol/liter zodpovedá 0,34 mg amoniaku.

Vyjadrite výsledok ako percento zo vzorky.

Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

—	10 % v relatívnej hodnote pre obsah amoniaku nižší ako 1,0 %,

—	0,1 % v absolútnej hodnote pre obsah amoniaku 1,0 % alebo viac.

7.   Poznámky

Ak obsah amoniaku vo vzorke presiahne 0,6 %, pôvodný filtrát rozrieďte.

CONWAYOVE MISKY

Mierka 1/1

II.   DESTILÁCIOU

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah prchavých dusíkatých látok, vyjadrených ako amoniak, v rybej múčke, ktorá prakticky neobsahuje močovinu. Používa sa len pri obsahu amoniaku nižšom ako 0,25 %.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa extrahuje s vodou a roztok sa vyčíri a prefiltruje. Prchavé dusíkaté látky sa vytesnia pri bode varu pridaním oxidu horečnatého a zachytia v špecifikovanom množstve kyseliny sírovej, ktorej prebytok sa spätne titruje s roztokom hydroxidu sodného.

3.   Chemikálie

3.1.	Kyselina trichlóroctová, roztok 20 % (w/v).

3.2.	Oxid horečnatý.

3.3.	Emulzia proti peneniu (napr. silikón).

3.4.	Kyselina sírová, 0,05 mol/liter.

3.5.	Roztok hydroxidu sodného 0,1 mol/liter.

3.6.	Roztok metylčervene 0,3 % v 95 % – 96 % (v/v) etanole.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Mixér (trepačka): približne 35 až 40 ot/min.

4.2.	Kjeldahlov destilačný prístroj.

5.   Postup

Navážte 10 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte ju spolu so 100 ml vody do odmernej banky s objemom 200 ml. Mixujte alebo miešajte v trepačke 30 minút. Pridajte 50 ml roztoku kyseliny trichlóroctovej (3.1), doplňte objem vodou, rázne potrepte a prefiltrujte cez skladaný filter.

Odoberte čistý filtrát v množstve primeranom predpokladanému obsahu prchavých dusíkatých látok (100 ml je zvyčajne vhodné množstvo). Rozrieďte na 200 ml a pridajte 2 g oxidu horečnatého (3.2) a niekoľko kvapiek emulzie proti peneniu (3.3). Roztok musí reagovať na lakmusový papier zásadito; v opačnom prípade pridajte trochu oxidu horečnatého (3.2). Postupujte podľa bodov 5.2 a 5.3 analytickej metódy na stanovenie obsahu dusíkatých látok (časť C tejto prílohy).

Urobte slepý pokus podľa toho istého postupu, no bez vzorky, ktorá sa má analyzovať.

6.   Výpočet výsledkov

1 ml H2SO40,05 mol/liter zodpovedá 1,7 mg amoniaku.

Výsledok sa vyjadrí ako percento zo vzorky.

Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 10 % amoniaku v relatívnej hodnote.

F.   STANOVENIE AMINOKYSELÍN (OKREM TRYPTOFÁNU)

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie voľných (syntetických a prírodných) a celkových (viazaných peptidickou väzbou a voľných) aminokyselín v krmivách s použitím analyzátora aminokyselín. Je použiteľná pre tieto aminokyseliny: cysteín (cystín), metionín, lyzín, treonín, alanín, arginín, kyselinu asparágovú, kyselinu glutámovú, glycín, histidín, izoleucín, leucín, fenylalanín, prolín, serín, tyrozín a valín.

Táto metóda nedokáže rozlíšiť soli aminokyselín a nedokáže diferencovať medzi D a L formami aminokyselín. Neplatí pre stanovenie tryptofánu alebo hydroxyanalógov aminokyselín.

2.   Podstata metódy

2.1.   Voľné aminokyseliny

Voľné aminokyseliny sa extrahujú zriedenou kyselinou chlorovodíkovou. Spolu vyextrahované dusíkové makromolekuly sa vyzrážajú kyselinou sulfosalicylovou a odstránia sa filtráciou. Hodnota pH prefiltrovaného roztoku sa upraví na 2,20. Aminokyseliny sa oddelia pomocou iónovo-výmennej chromatografie a stanovia sa reakciou s ninhydrínom pomocou fotometrickej detekcie pri 570 nm.

2.2.   Celkové aminokyseliny

Zvolený postup závisí od aminokyselín, ktoré sa majú skúmať. Cysteín (cystín) a metionín sa musia pred hydrolýzou zoxidovať na kyselinu cysteovú a metionín sulfón. Tyrozín sa musí stanoviť v hydrolyzátoch neoxidovaných vzoriek. Všetky ostatné aminokyseliny uvedené v bode 1 sa dajú stanoviť v oxidovanej alebo neoxidovanej vzorke.

Oxidácia sa vykoná pri 0 oC zmesou kyseliny permravčej a fenolu. Prebytočné oxidačné činidlo sa rozloží pomocou disiričitanu disodného. Oxidovaná alebo neoxidovaná vzorka sa hydrolizuje 23 hodín kyselinou chlorovodíkovou (3.20). Hodnota pH hydrolyzátu sa upraví na 2,20. Aminokyseliny sa oddelia pomocou iónovo-výmennej chromatografie a stanovia sa reakciou s ninhydrínom pomocou fotometrickej detekcie pri 570 nm (v prípade prolínu pri 440 nm).

3.   Chemikálie

Musí sa použiť dvakrát destilovaná voda alebo voda rovnakej kvality (vodivosť < 10μS).

3.1.	Peroxid vodíka, w (w/w) = 30 %.

3.2.	Kyselina mravčia, w (w/w) = 98 – 100 %.

3.3.

Fenol.

3.4.	Disiričitan sodný

3.5.	Hydroxid sodný

3.6.	Dihydrát kyseliny 5-sulfosalicylovej

3.7.	Kyselina chlorovodíková, hustota približne 1,18 g/ml.

3.8.	Dihydrát citranu trojsodného.

3.9.	2,2'-tiodietanol (tiodiglykol).

3.10.

Chlorid sodný.

3.11.

Ninhydrín.

3.12.

Petroléter, rozpätie bodu varu 40 – 60 oC.

3.13.

Norleucín alebo iná zlúčenina vhodná na použitie ako vnútorný štandard.

3.14.

Plynný dusík (< 10 ppm kyslíka).

3.15.

1-oktanol.

3.16.

Aminokyseliny.

3.16.1.

Štandardné látky uvedené v odseku 1. Čisté zlúčeniny bez obsahu vody z kryštalizácie. Pred použitím ich sušte vo vákuu jeden týždeň nad P2O5 alebo H2SO4.

3.16.2.

Kyselina cysteová

3.16.3.

Metionín sulfón.

3.17.

Roztok hydroxidu sodného c = 7,5 mol/l: Rozpustite 300 g NaOH (3.5) vo vode a objem doplňte na 1 liter.

3.18.

Roztok hydroxidu sodného c = 1 mol/l: Rozpustite 40 g NaOH (3.5) vo vode a objem doplňte na 1 liter.

3.19.

Roztok kyseliny mravčej a fenolu: Zmiešajte 889 g kyseliny mravčej (3.2) so 111 g vody a pridajte 4,73 g fenolu (3.3).

3.20.

Hydrolyzačná zmes, c = 6 mol HCl/l s obsahom 1 g fenolu/l: Pridajte 1 g fenolu (3.3) k 492 ml HCl (3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.21.

Extrakčná zmes, c = 0,1 mol HCl/l s obsahom 2 % tiodiglykolu: Vezmite 8,2 ml HCl (3.7), rozrieďte s približne 900 ml vody, pridajte 20 ml tiodiglykolu (3.9) a objem doplňte vodou na 1 liter (nezmiešajte 3.7 a 3.9 priamo).

3.22.

Kyselina 5-sulfosalicylova, ß = 6 %: Rozpustite 60 g kyseliny 5-sulfosalicylovej (3.6) vo vode a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.23.

Oxidačná zmes (kyselina permravčia – fenol): Zmiešajte 0,5 ml peroxidu vodíka (3.1) so 4,5 ml roztoku kyseliny mravčej s fenolom (3.19) v malej kadičke. Inkubujte pri teplote 20 – 30 oC 1 hodinu, aby sa vytvorila kyselina permravčia, potom nechajte vychladnúť v ľadovom kúpeli (15 minút) pred pridaním k vzorke. Upozornenie: Vyhnite sa kontaktu s kožou a použite ochranný odev.

3.24.

Citranový tlmivý roztok, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Rozpustite 19,61 g citranu sodného (3.8), 5 ml tioglykolu (3.9), 1 g fenolu (3.3) a 16,50 ml HCl (3.7) v približne 800 ml vody. Upravte pH na 2,20. Doplňte objem vodou na 1 liter.

3.25.

Elučné tlmivé roztoky pripravené podľa podmienok pre použitý analyzátor (4.9).

3.26.

Nihydrinové činidlo pripravené podľa podmienok pre použitý analyzátor (4.9).

3.27.

Štandardné roztoky aminokyselín. Tieto roztoky treba skladovať pri teplote pod 5 oC.

3.27.1.

Zásobný štandardný roztok aminokyselín (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml každá v kyseline chlorovodíkovej. Možno ich získať aj komerčne.

3.27.2.

Zásobný štandardný roztok kyseliny cysteovej a metionín sulfónu, c = 1,25 μmol/ml. Rozpustite 0,2115 g kyseliny cysteovej (3.16.2) a 0,2265 g metionín sulfónu (3.16.3) v citranovom tlmivom roztoku (3.24) v 1 l odmernej banke a doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom. Skladujte pri teplote pod 5 oC najviac podobu 12 mesiacov. Tento roztok sa nepoužíva, ak zásobný štandardný roztok (3.27.1) obsahuje kyselinu cysteovú a metionín sulfón.

3.27.3.

Zásobný štandardný roztok vnútorného štandardu napr. norleucín, c = 20 μmol/ml. Rozpustite 0,6560 g norleucínu (3.13) v citranovom tlmivom roztoku (3.24) v odmernej banke a doplňte objem citranovým tlmivým roztokom na 250 ml. Skladujte pri teplote pod 5 oC najviac po dobu 6 mesiacov.

3.27.4.

Kalibračný roztok štandardných aminokyselín na použitie s hydrolyzátmi, c = 5 nmol/50 μl kyseliny cysteovej a metionín sulfónu a c = 10 nmol/50 μl ostatných aminokyselín. Rozpustite 2,2 g chloridu sodného (3.10) v 100 ml kadičke s 30 ml citranového tlmivého roztoku (3.24). Pridajte 4,00 ml zásobného štandardného roztoku aminokyselín (3.27.1), 4,00 ml zásobného štandardného roztoku kyseliny cysteovej a metionín sulfónu (3.27.2) a 0,50 ml zásobného štandardného roztoku vnútorného štandardu (3.27.3), ak sa používa. Hydroxidom sodným (3.18) upravte pH na 2,20. Preneste kvantitatívne do 50 ml odmernej banky a doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom (3.24) a premiešajte. Skladujte pri teplote pod 5 oC najviac po dobu 3 mesiacov. Pozri poznámku 9.1.

3.27.5.

Kalibračný roztok štandardných aminokyselín na použitie s hydrolyzátmi pripravenými podľa odseku 5.3.3.1 a na použitie s extraktmi (5.2). Kalibračný roztok sa pripravuje podľa 3.27.4, no bez použitia chloridu sodného. Skladujte pri teplote pod 5 oC po dobu najviac 3 mesiace.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Banka s guľatým dnom s objemom 100 alebo 250 ml vybavená spätným chladičom.

4.2.	Fľaša z borokremičitého skla s objemom 100 ml so skrutkovým uzáverom s gumovou/teflonovou podložkou (napr. Duran, Schott) na použitie v sušiarni.

4.3.	Sušiareň s nútenou ventiláciou a regulátorom teploty s presnosťou vyššou ako ± 2 oC.

4.4.	pH meter (s presnosťou na tri desatinné miesta).

4.5.	Membránový filter (0,22 μm).

4.6.	Odstredivka.

4.7.	Rotačná vákuová odparka.

4.8.	Mechanická trepačka alebo magnetické miešadlo.

4.9.

Analyzátor aminokyselín alebo zariadenie HPLC s iónovo-výmennou kolónou, zariadenie pre ninhydrín, postkolónová derivatizačná jednotka a fotometrický detektor. Kolóna je naplnená sulfónovanými polystyrénovými živicami, ktoré sú schopné oddeliť aminokyseliny navzájom, ako aj od iných ninhydrín-pozitívnych materiálov. Prietok pre tlmivý roztok a ninhydrín zabezpečujú pumpy, ktoré majú stabilitu prietoku ±0,5 % v dobe, počas ktorej sa vykoná aj kalibrácia pomocou štandardu aj analyzovanie vzorky. U niektorých analyzátorov aminokyselín sa môžu použiť také postupy hydrolýzy, v ktorých hydrolyzát má koncentráciu sodíka c = 0,8 mol/l a obsahuje všetku zvyškovú kyselinu mravčiu z oxidácie. Iné analyzátory nedokážu uspokojivo oddeliť aminokyseliny, ak hydrolyzát obsahuje prebytok kyseliny mravčej a/alebo vysoké koncentrácie sodíkového iónu. V tomto prípade sa objem kyseliny zredukuje odparením na približne 5 ml po hydrolýze a pred úpravou pH. Odparenie musí prebehnúť vo vákuu pri teplote najviac 40 oC.

5.   Postup

5.1.   Príprava vzorky

Vzorka sa pomelie tak, aby prepadla sitom s veľkosťou ôk 0,5 mm. Vzorky s vysokým obsahom vlhkosti sa pred mletím musia vysušiť buď vzduchom pri teplote do 50 oC, alebo lyofilizáciou. Vzorky s vysokým obsahom tuku treba pred mletím extrahovať s petroléterom (3.12).

5.2.   Stanovenie voľných aminokyselín v krmivách a v premixoch

Navážte s presnosťou na 0,2 mg primerané množstvo (1 – 5 g) pripravenej vzorky (5.1) do Erlenmeyerovej banky a pridajte 100,0 ml extrakčnej zmesi (3.21). Zmes trepte 60 min. použitím mechanickej trepačky alebo magnetického miešadla (4.8). Nechajte sediment usadiť a pipetou odoberte 10,0 ml z roztoku nad sedimentom do kadičky s objemom 100 ml.

Primiešajte 5,0 ml roztoku kyseliny 5-sulfosalicylovej (3.22) a pokračujte v miešaní pomocou magnetického miešadla po dobu 5 minút. Roztok nad sedimentom odstreďte alebo prefiltrujte, aby sa odstránili všetky zrazeniny. Preneste 10,0 ml výsledného roztoku do 100 ml kadičky a upravte pH na 2,20 použitím roztoku hydroxidu sodného (3.18), preneste do odmernej banky primeraného objemu s použitím citranového tlmivého roztoku (3.24) a doplňte týmto roztokom (3.24) po značku.

Ak sa používa vnútorný štandard, pridajte 1,00 ml vnútorného štandardu (3.27.3) na každých 100 ml konečného roztoku a doplňte citranovým tlmivým roztokom (3.24) po značku.

Pristúpte k ďalšiemu kroku, ktorým je chromatografia, podľa odseku 5.4.

Ak sa extrakty neanalyzujú v ten istý deň, musia sa uskladniť pri teplote pod 5 oC.

5.3.   Stanovenie celkových aminokyselín

5.3.1.   Oxidácia

Navážte s presnosťou na 0,2 mg 0,1 – 1 g pripravenej vzorky (5.1) do:

—	100 ml banky s guľatým dnom (4.1) na otvorenú hydrolýzu (5.3.2.3) alebo

—	250 banky s guľatým dnom (4.1), ak sa vyžaduje nízka koncentrácia sodíka (5.3.3.1), alebo

—	100 ml fľaše so skrutkovým uzáverom (4.2) (na uzavretú hydrolýzu 5.3.2.4).

Navážené množstvo vzorky musí mať obsah dusíka približne 10 mg a obsah vlhkosti nesmie presahovať 100 mg.

Vložte banku/fľašu do ľadového vodného kúpeľa a ochlaďte na 0 oC, pridajte 5 ml oxidačnej zmesi (3.23) a premiešajte sklenenou špachtľou s ohnutým hrotom. Utesnite banku/fľašu, v ktorej je špachtľa, vzduchotesnou fóliou, vložte ľadový vodný kúpeľ s utesnenou nádobou do chladničky pri teplote 0 oC a nechajte pôsobiť 16 hodín. Po 16 hodinách vyberte z chladničky a rozložte prebytok oxidačného činidla pridaním 0,84 g disiričitanu sodného (3.4).

Prejdite k bodu 5.3.2.1.

5.3.2.   Hydrolýza

5.3.2.1.    Hydrolýza oxidovaných vzoriek

K oxidovanej vzorke pripravenej podľa 5.3.1 pridajte 25 ml hydrolyzačnej zmesi (3.20), pričom pozorne zmyte všetky zvyšky vzorky, ktoré sa držia na stranách nádoby a špachtle.

V závislosti od použitého postupu hydrolýzy postupujte podľa 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4.

5.3.2.2.    Hydrolýza neoxidovaných vzoriek

Navážte do 100 ml alebo 250 ml banky s guľatým dnom (4.1) alebo do 100 ml fľaše so skrutkovým uzáverom (4.2) 0,1 až 1 g pripravenej vzorky (5.1) s presnosťou na 0,2 mg. Navážené množstvo vzorky musí mať obsah dusíka približne 10 mg. Opatrne pridajte 25 ml hydrolyzačnej zmesi (3.20) a zmiešajte so vzorkou. Postupujte podľa bodu 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4.

5.3.2.3.    Otvorená hydrolýza

Pridajte 3 sklenené guľôčky k zmesi v banke (pripravenej v súlade s bodom 5.3.2.1 alebo 5.3.2.2) a varte pri stálom prebublávaní s refluxom 23 hodín. Po dokončení hydrolýzy chladič umyte 5 ml v citranového tlmivého roztoku (3.24). Odpojte banku a ochlaďte v ľadovom kúpeli.

Postupujte podľa bodu 5.3.3.

5.3.2.4.    Uzavretá hydrolýza

Vložte fľašu s obsahom zmesi pripravenej v súlade s bodom 5.3.2.1 alebo 5.3.2.2 do sušiarne (4.3) pri teplote 110 oC. Počas prvej hodiny len položte na vrch nádoby skrutkový uzáver, aby ste predišli vytvoreniu tlaku (v dôsledku vytvárania plynných látok) a zabránili výbuchu. Nezatvárajte nádobu uzáverom. Po hodine uzatvorte nádobu uzáverom a nechajte na 23 hodín v sušiarni (4.3). Po ukončení hydrolýzy vyberte fľašu zo sušiarne, opatrne otvorte uzáver fľaše a vložte ju do ľadového vodného kúpeľa. Nechajte vychladnúť.

V závislosti od postupu na úpravu pH (5.3.3) preneste kvantitatívne obsah fľaše do 250 ml kadičky alebo 250 ml alebo 250 ml banky s guľatým dnom s použitím citranového tlmivého roztoku (3.24).

Postupujte podľa bodu 5.3.3.

5.3.3.   Úprava pH

V závislosti od tolerancie analyzátora aminokyselín (4.9) voči sodíku postupujte pri úprave pH podľa bodov 5.3.3.1 alebo 5.3.3.2.

5.3.3.1.    Chromatografické systémy (4.9) vyžadujúce nízku koncentráciu sodíka.

Pri použití analyzátora, ktorý vyžaduje nízku koncentráciu sodíka (keď sa musí znížiť objem kyseliny), sa odporúča použiť zásobný roztok vnútorného štandardu (3.27.3).

V takomto prípade pridajte k hydrolyzátu pred odparovaním 2,00 ml zásobného roztoku vnútorného štandardu (3.27.3).

Pridajte 2 kvapky 1-oktanolu (3.15) k hydrolyzátu získanému podľa ods. 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4.

Použitím rotačnej odparky (4.7) znížte objem na 5 – 10 ml vo vákuu pri teplote 40 oC. Ak sa objem náhodou zníži na menej ako 5 ml, hydrolyzát sa musí znehodnotiť a analýza opakovať.

Upravte pH na 2,20 s roztokom hydroxidu sodného (3.18) a postupujte ďalej podľa odseku 5.3.4.

5.3.3.2.    Pre všetky ostatné analyzátory aminokyselín (4.9)

Vezmite hydrolyzáty získané podľa bodov 5.3.2.3 alebo 5.3.2.4 a čiastočne ich zneutralizujte opatrným pridávaním za miešania 17 ml roztoku hydroxidu sodného (3.17), pričom je potrebné zabezpečiť, aby sa teplota udržala pod 40 oC.

Upravte pH na 2,20 pri izbovej teplote použitím roztoku hydroxidu sodného (3.17) a nakoniec roztoku hydroxidu sodného (3.18). Postupujte ďalej podľa bodu 5.3.4.

5.3.4.   Roztok vzorky na chromatografiu

Kvantitatívne preneste hydrolyzát s upraveným pH (5.3.3.1 alebo 5.3.3.2) s citranovým tlmivým roztokom (3.24) do 200 ml odmernej banky a doplňte po značku tlmivým roztokom (3.24).

Ak ešte nebol použitý vnútorný štandard, pridajte 2,00 ml vnútorného štandardu (3.27.3) a doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom (3.24). Dôkladne premiešajte.

Pristúpte ďalej ku chromatografii (5.4).

Ak sa roztoky vzorky neanalyzujú v ten istý deň, musia sa uskladniť pri teplote pod 5 oC.

5.4.   Chromatografia

Pred chromatografiou upravte teplotu extraktu (5.2) alebo hydrolyzátu (5.3.4) na laboratórnu teplotu. Zmes potrepte a prefiltrujte vhodné množstvo cez 0,22 μm membránový filter (4.5). Výsledný číry roztok sa podrobí iónovo-výmennej chromatografii s použitím analyzátora aminokyselín (4.9).

Nastreknutie sa môže vykonať manuálne alebo automaticky. Dôležité je, aby sa na kolónu nadávkovalo rovnaké analyzované množstvo roztoku štandardov a vzoriek s odchýlkou ±0,5 % s výnimkou prípadov používania vnútorného štandardu a aby boli pomery sodíka a aminokyselín v roztokoch štandardu a vzorky v najvyššej možnej miere podobné.

Vo všeobecnosti závisí frekvencia kalibrácií od stability ninhydrínového činidla a analytického systému. Štandard alebo vzorka sa rozriedi s citranovým tlmivým roztokom (3.24) tak, aby plocha píku štandardu predstavovala 30 – 200 % plochy píku aminokyseliny vzorky.

Chromatografia aminokyselín sa mierne odlišuje podľa typu použitého analyzátora a použitej živice. Zvolený systém musí byť schopný oddeliť aminokyseliny navzájom, ako aj od iných ninhydrín-pozitívnych materiálov. V pracovnom rozsahu musí chromatografický systém poskytnúť lineárnu odozvu na zmeny v množstvách aminokyselín pridaných do kolóny.

Počas chromatografie, keď sa analyzuje ekvimolárny roztok (aminokyselín, ktoré sa stanovujú), sa uplatňujú pomery výšky údolia k výške píku, ako sa uvádza nižšie. Tento ekvimolárny roztok musí obsahovať najmenej 30 % maximálneho množstva každej aminokyseliny, ktorá sa dá presne odmerať pomocou systému analyzátora aminokyselín (4.9).

Pri oddeľovaní treonínu od serínu výška údolia k výške píku u nižšej z dvoch prekrývajúcich sa aminokyselín na chromatograme nesmie prekročiť pomer 2 : 10 (ak sa stanovuje len cystín, cysteín, metionín, treonin a lysín, nedostatočné oddelenie od susedných píkov nepriaznivo ovplyvní proces stanovenia). Pri všetkých ostatných aminokyselinách musí byť oddelenie v pomere lepšom ako 1 : 10.

Systém musí zabezpečiť, aby sa lyzín oddelil od „lyzínových artefaktov“ a od ornitínu.

6.   Výpočet výsledkov

Plochy píkov vzorky a štandardu sa merajú pre každú jednotlivú aminokyselinu a vypočíta sa množstvo (X) v g aminokyselín na kg vzorky.

Ak sa použije vnútorný štandard, vynásobte:

A	=	plocha píku, hydrolyzátu alebo extraktu,
B	=	plocha píku, kalibračný štandardný roztok,
C	=	plocha píku, vnútorny štandard v hydrolyzáte alebo extrakte,
D	=	plocha píku, vnútorny štandard, kalibračný štandardný roztok,
M	=	molekulová hmotnosť aminokyseliny, ktorá sa stanovuje,
c	=	koncentrácia štandardu v μmol/ml,
m	=	hmotnosť vzorky (g) (upravená na pôvodnú hmotnosť ak je sušená alebo odtučnená),
V	=	celkový hydrolyzát v ml (5.3.4) alebo vypočítaný objem celkového zriedenia extraktu (6.1).

Cystín a cysteín sa obidva stanovujú ako kyselina cysteová v hydrolyzátoch oxidovanej vzorky, no vypočítajú sa ako cystín (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) pomocou M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionín sa stanovuje ako metionín sulfón v hydrolyzátoch oxidovanej vzorky, no vypočíta sa ako metionín pomocou M metionínu: 149,21 g/mol.

Pridaný voľný metionín sa stanovuje po extrakcii ako metionín a výpočet sa vykoná pomocou toho istého MW.

6.1.	Celkový objem zriedených extraktov (F) na stanovenie voľných aminokyselín (5.2) sa vypočíta takto: V = objem konečného extraktu

7.   Hodnotenie metódy

Metóda bola testovaná v rámci vzájomného porovnávania na medzinárodnej úrovni v roku 1990 pomocou štyroch rôznych krmív (kŕmna zmes pre ošípané, kŕmna zmes pre brojlery, bielkovinový koncentrát, premix). Výsledky priemeru a smerodajnej odchýlky po eliminácii odľahlých hodnôt sú uvedené v atbuľkách v tomto bode:

Priemery v g/kg

Referenčný materiál	Aminokyselina
	Treonín	Cyst(e)ín	Metionín	Lysín
Kŕmna zmes pre ošípané	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Kŕmna zmes pre brojlery	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Bielkovinový koncentrát	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Premix	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = počet zúčastnených laboratórií

7.1.   Opakovateľnosť

Opakovateľnosť vyjadrená ako „vnútrolaboratórna smerodajná odchýlka“ uvedeného vzájomného porovnávania je uvedená v nasledujúcich tabuľkách:

Vnútrolaboratórna smerodajná odchýlka (Sr) v g/kg

Referenčný materiál	Aminokyselina
	Treonín	Cyst(e)ín	Metionín	Lysín
Kŕmna zmes pre ošípané	0,13 n = 15	0,10 n = 17	0,11 n = 17	0,26 n = 13
Kŕmna zmes pre brojlery	0,20 n = 16	0,11 n = 18	0,16 n = 18	0,28 n = 16
Bielkovinový koncentrát	0,48 n = 16	0,13 n = 17	0,27 n = 17	0,99 n = 15
Premix	1,30 n = 16	—	2,19 n = 16	2,06 n = 16
n = počet zúčastnených laboratórií

Variačný koeficient (%) vnútrolaboratórnej smerodajnej odchýlky (Sr)

Referenčný materiál	Aminokyselina
	Treonín	Cyst(e)ín	Metionín	Lysín
Kŕmna zmes pre ošípané	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Kŕmna zmes pre brojlery	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Bielkovinový koncentrát	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Premix	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = počet zúčastnených laboratórií

7.2.   Reprodukovateľnosť

Výsledky medzilaboratórnej smerodajnej odchýlky na základe uvedeného vzájomného porovnávania sú uvedené v nasledujúcich tabuľkách:

Medzilaboratórna smerodajná odchýlka (SR) v g/kg

Referenčný materiál	Aminokyselina
	Treonín	Cyst(e)ín	Metionín	Lysín
Kŕmna zmes pre ošípané	0,28 n = 15	0,30 n = 17	0,23 n = 17	0,30 n = 13
Kŕmna zmes pre brojlery	0,48 n = 16	0,34 n = 18	0,55 n = 18	0,75 n = 16
Bielkovinový koncentrát	0,85 n = 16	0,62 n = 17	1,57 n = 17	1,24 n = 15
Premix	2,49 n = 16	—	6,20 n = 16	6,62 n = 16
n = počet zúčastnených laboratórií

Variačný koeficient (%) medzilaboratórnej smerodajnej odchýlky (SR)

Referenčný materiál	Aminokyselina
	Treonín	Cyst(e)ín	Metionín	Lysín
Kŕmna zmes pre ošípané	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Kŕmna zmes pre brojlery	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Bielkovinový koncentrát	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Premix	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = počet zúčastnených laboratórií

8.   Využitie referenčných materiálov

Správne uplatňovanie tejto metódy sa overí vykonaním opakovaných meraní certifikovaných referenčných materiálov, ak sú takéto materiály k dispozícii. Odporúča sa kalibrácia certifikovaným kalibračným roztokom aminokyselín.

9.   Poznámky

9.1.

V dôsledku rozdielov medzi analyzátormi aminokyselín sa berú za základ konečné koncentrácie kalibračných roztokov štandardných aminokyselín (pozri body 3.27.4 a 3.27.5) a hydrolyzátu (pozri 5.3.4). Rozsah lineárnej odozvy prístroja sa musí preveriť pre všetky aminokyseliny. Štandardný roztok sa zriedi s citranovým tlmivým roztokom tak, aby plochy píkov boli v strede rozsahu.

9.2.	V prípade použitia zariadenia na vysoko účinnú kvapalinovú chromatografiu na analýzu hydrolyzátov sa musia optimalizovať experimentálne podmienky v súlade s odporúčaniami výrobcu.

9.3.	Uplatňovaním tejto metódy na krmivá s obsahom viac ako 1 % chloridu (koncentrát, minerálne krmivá, doplnkové krmivá) môže dôjsť k podhodnoteniu metionínu a musí sa vykonať osobitná úprava.

G.   STANOVENIE TRYPTOFÁNU

1.   Účel a oblasť

Metóda umožňuje stanovenie celkového a voľného tryptofánu v krmivách. Nerozlišuje medzi D a L formami.

2.   Podstata metódy

Na stanovenie celkového tryptofánu sa vzorka hydrolyzuje v alkalickom prostredí s nasýteným roztokom hydroxidu bárnatého a zahreje sa na 110 oC na 20 hodín. Po hydrolýze sa pridá vnútorný štandard.

Na stanovenie voľného tryptofánu sa vzorka extrahuje v mierne kyslom prostredí v prítomnosti vnútorného štandardu.

Tryptofán a vnútorný štandard v hydrolyzáte alebo v extrakte sa stanovujú pomocou HPLC s fluorescenčnou detekciou.

3.   Chemikálie

3.1.	Musí sa použiť dvakrát destilovaná voda alebo voda rovnakej kvality (vodivosť < 10 μS/cm).

3.2.	Štandardná látka: tryptofán (čistota/obsah ≥ 99 %) vysušený vo vákuu nad oxidom fosforečným.

3.3.	Vnútorný štandard: α-metyl-tryptofán (čistota/obsah ≥ 99 %) vysušený vo vákuu nad oxidom fosforečným.

3.4.	Oktahydrát hydroxidu bárnatého Ba(OH)2 8H2O (ktorý sa nesmie nechať dlho na vzduchu, aby sa nevytváral BaCO3, ktorý môže narušiť proces stanovenia) (pozri poznámku 9.3).

3.5.	Hydroxid sodný.

3.6.	Kyselina orto-fosforečná, w (w/w) = 85 %.

3.7.	Kyselina chlorovodíková, ρ201,19 g/ml.

3.8.	Metanol, čistoty HPLC.

3.9.	Petroléter, rozpätie bodu varu 40 – 60 oC.

3.10.

Roztok hydroxidu sodného c = 1 mol/l: Rozpustite 40,0 g NaOH (3.5) vo vode a objem doplňte vodou na 1 liter (3.1).

3.11.

Kyselina chlorovodíková, c = 6 mol/l: Vezmite 492 ml HCl (3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.12.

Kyselina chlorovodíková, c = 1 mol/l: Vezmite 82 ml HCl (3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.13.

Kyselina chlorovodíková, c = 0,1 mol/l: Vezmite 8,2 ml HCl (3.7) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.14.

Kyselina orto-fosforečná, c = 0,5 mol/l. Vezmite 34 ml kyseliny orto-fosforečnej (3.6) a objem doplňte vodou na 1 liter (3.1).

3.15.

Koncentrovaný roztok tryptofánu (3.2), c = 2,50 μmol/ml: V 500 ml odmernej banke rozpustite 0,2553 g tryptofánu (3.2) v kyseline chlorovodíkovej (3.13) a doplňte kyselinou chlorovodíkovou (3.13) po značku. Skladujte pri teplote –18 oC po dobu maximálne 4 týždne.

3.16.

Koncentrovaný roztok vnútorného štandardu, c = 2,50 μmol/ml: V 500 ml odmernej banke rozpustite 0,2728 g α-metyl-tryptofánu (3.3) v kyseline chlorovodíkovej (3.13) a doplňte kyselinou chlorovodíkovou (3.13) po značku. Skladujte pri teplote –18 oC po dobu maximálne 4 týždne.

3.17.

Kalibračný štandardný roztok tryptofánu a vnútorného štandardu: Vezmite 2,00 ml koncentrovaného roztoku tryptofánu (3.15) a 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (α-metyl-tryptofán) (3.16). Rozrieďte s vodou (3.1) a metanolom (3.8) na približne rovnaký objem a na približne rovnakú koncentráciu metanolu (10 – 30 %) ako hotový hydrolyzát. Tento roztok sa musí pripraviť tesne pred použitím. Počas prípravy chráňte ho pred priamym slnečným svetlom.

3.18.

Kyselina octová

3.19.

1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanol

3.20.

Etanolamín w (w/w) > 98 %.

3.21.

Roztok 1 g 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19) v 100 ml metanolu (3.8).

3.22.

Mobilná fáza pre HPLC: 3,00 g kyseliny octovej (3.18) + 900 ml vody (3.1) +50,0 ml roztoku (3.21) 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19) v metanole (3.8) (1g/100ml). Upravte pH na 5,00 pomocou etanolamínu (3.20). Objem doplňte vodou (3.1) na 1 000 ml.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Zariadenie HPLC s fluorescenčným detektorom.

4.2.	Kolóna na kvapalinovú chromatografiu, 125 mm × 4 mm, s náplňou C18, 3 μm alebo ekvivalentná

4.3.

pH meter.

4.4.	Polypropylénová banka, objem 125 ml so širokým hrdlom a závitovým uzáverom.

4.5.	Membránový filter, 0,45 μm.

4.6.	Autokláv, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar.

4.7.	Mechanická trepačka alebo magnetická miešačka.

4.8.	Vírivý mixér.

5.   Postup

5.1.   Príprava vzoriek

Vzorka sa pomelie tak, aby prepadla cez sito o veľkosti ôk 0,5 mm. Vzorky s vysokým obsahom vlhkosti sa pred mletím musia vysušiť buď vzduchom pri teplote do 50 oC, alebo lyofilizáciou. Vzorky s vysokým obsahom tuku sa pred mletím extrahujú petroléterom (3.9).

5.2.   Stanovenie voľného tryptofánu (extrakt)

Navážte s presnosťou na 1 mg primerané množstvo (1 – 5 g) pripravenej vzorky (5.1) do Erlenmayerovej banky. Pridajte 100,0 ml kyseliny chlorovodíkovej, (3.13) a 5,00 ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (3.16). Zmes trepte alebo miešajte 60 min. na mechanickej trepačke alebo na magnetickej miešačke (4.7). Nechajte sediment usadiť a napipetujte 10,0 ml z roztoku nad sedimentom do kadičky. Pridajte 5 ml kyseliny orto-fosforečnej (3.14). Upravte pH na 3 pomocou hydroxidu sodného (3.10). Pridajte dostatočné množstvo metanolu (3.8) na dosiahnutie koncentrácie medzi 10 a 30 % metanolu v konečnom objeme. Preneste do odmernej banky primeraného objemu a rozrieďte s vodou na objem potrebný na chromatografiu [približne rovnaký objem ako je objem kalibračného štandardného roztoku (3.17)].

Prefiltrujte niekoľko ml roztoku cez 0,45 μm membránový filter (4.5) pred nástrekom na HPLC kolónu. Pokračujte ďalším krokom chromatografie podľa odseku 5.4.

Roztok štandardu a extrakty chráňte pred priamym slnečným svetlom. Ak nie je možné analyzovať extrakty v ten istý deň, môžu sa uskladniť pri teplote 5 oC maximálne počas 3 dní.

5.3.   Stanovenie celkového tryptofánu (hydrolyzát).

Navážte s presnosťou na 0,2 mg od 0,1 do 1 g pripravenej vzorky (5.1) do polypropylénovej banky (4.4). Navážka vzorky má obsahovať približne 10 mg dusíka. Pridajte 8,4 g oktahydrátu hydroxidu bárnatého (3.4) a 10 ml vody. Premiešajte vo vírivom mixéri (4.8) alebo na magnetickej miešačke (4.7). Magnet potiahnutý teflónom ponechajte v zmesi. Steny nádoby opláchnite 4 ml vody. Položte na ňu skrutkový uzáver a voľne banku uzatvorte. Preneste do autoklávu (4.6) s vriacou vodou a nechajte v pare 30 – 60 minút. Uzatvorte autokláv a autoklávujte 20 hodín pri 110 (± 2) oC.

Pred otvorením autoklávu znížte teplotu na hodnotu tesne pod 100 oC. K teplej zmesi pridajte 30 ml vody laboratórnej teploty, aby ste sa vyhli kryštalizácii Ba(OH)2.8 H2O. Jemne potrepte alebo premiešajte. Pridajte 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (α-metyl-tryptofán) (3.16). Nechajte nádobu 15 minút ochladzovať vo vodnom/ľadovom kúpeli.

Potom pridajte 5 ml kyseliny orto-fosforečnej (3.14). Nádobu nechajte v chladiacom kúpeli a neutralizujte pomocou HCl (3.11) za stáleho miešania a upravte pH na 3,0 pomocou HCl (3.12). Pridajte dostatočné množstvo metanolu na dosiahnutie koncentrácie medzi 10 a 30 % metanolu v konečnom objeme. Preneste do odmernej banky primeraného objemu a zrieďte s vodou, aby sa dosiahol stanovený objem potrebný na chromatografiu (napr. 100 ml). Pridanie metanolu nesmie spôsobiť vyzrážanie.

Prefiltrujte niekoľko ml roztoku cez 0,45 μm membránový filter (4.5) pred nástrekom na HPLC kolónu. Ďalším krokom je chromatografia podľa odseku 5.4.

Roztok štandardu a hydrolyzáty chráňte pred priamym slnečným svetlom. Ak nie je možné analyzovať hydrolyzáty v ten istý deň, môžu sa uskladniť pri teplote 5 oC maximálne počas 3 dní.

5.4.   Stanovenie HPLC

Na usmernenie sú k dispozícii tieto podmienky pre izokratické eluovanie; môžu sa uplatniť iné podmienky, ak poskytujú rovnaké výsledky (pozri poznámky 9.1 a 9.2):

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu kolóna (4.2):	125 mm × 4 mm, s náplňou C18, 3 μm alebo ekvivalentná
Teplota kolóny:	laboratórna teplota
Mobilná fáza (3.22):	3,00 g kyseliny octovej (3.18) + 900 ml vody (3.1) +50,0 ml roztoku (3.21) 1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19) v metanole (3.8) (1 g/100 ml). Upravte pH na 5,00 pomocou tanolamínu (3.20). Doplňte objem vodou (3.1) na 1 000 ml
Prietoková rýchlosť:	1 ml/min.
Celkový čas analýzy:	približne 34 min.
Detekčná vlnová dĺžka:	excitácia: 280 nm, emisia: 356 nm
Vstrekový objem	20 μl

6.   Výpočet výsledkov

Množstvo tryptofánu (X) v g na 100 vzorky sa vypočíta podľa vzorca:

A	=	plocha píku vnútorného štandardu, kalibračného štandardného roztoku (3.17),
B	=	plocha píku extraktu tryptofánu (5.2) alebo hydrolyzátu (5.3),
V1	=	objem v ml (2 ml) koncentrovaného roztoku tryptofánu (3.15) pridaného do kalibračného roztoku (3.17),
c	=	koncentrácia v μmol/ml (= 2,50) koncentrovaného roztoku tryptofánu (3.15) pridaného do kalibračného roztoku (3.17),
V2	=	objem v ml koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (3.16) pridaného pri extrakcii (5.2) (= 5,00 ml) alebo k hydrolyzátu (5.3) (= 2,00 ml),
C	=	plocha píku vnútorného štandardu, extraktu (5.2) alebo hydrolyzátu (5.3),
D	=	plocha píku tryptofánu, kalibračného štandardného roztoku (3.17),
V3	=	objem v ml (= 2,00 ml) koncentrovaného roztoku vnútorného štandardu (3.16) pridaného do kalibračného štandardného roztoku (3.17),
m	=	hmotnosť vzorky v g (upravená na pôvodnú hmotnosť, ak je sušená a/alebo odtučnená),
M	=	molekulová hmotnosť tryptofánu (= 204,23 g/mol).

7.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 10 % relatívnych z vyššej hodnoty.

8.   Výsledky medzilaboratórnej štúdie

Zorganizovala sa medzilaboratórna štúdia ES (4. vzájomné porovnávanie), v ktorej sa analyzovali tri vzorky až v 12 laboratóriách na overenie metódy pre hydrolýzu. Každá vzorka sa analyzovala 5 krát. Výsledky sú uvedené v tejto tabuľke:

	Vzorka 1 Krmivo pre ošípané	Vzorka 2 Krmivo pre ošípané doplnené L-tryptofánom	Vzorka 3 Koncentrát krmiva pre ošípané
L	12	12	12
n	50	55	50
Priemery [g/kg]	2,42	3,40	4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [ %]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [ %]	6,3	6,0	2,2

L	=	počet laboratórií, ktoré poskytli výsledky,
n	=	počet jednotlivých výsledkov, ktoré zostali po eliminácii odľahlých hodnôt (určené Cochranovým, Dixonovým testom na odľahlé hodnoty),
sr	=	smerodajná odchýlka opakovateľnosti,
SR	=	smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti,
r	=	opakovateľnosť,
R	=	reprodukovateľnosť,
CVr	=	variačný koeficient opakovateľnosti, %,
CVR	=	variačný koeficient reprodukovateľnosti, %.

Zorganizovala sa ďalšia medzilaboratórna štúdia ES (3. vzájomné porovnávanie), v ktorej sa analyzovali dve vzorky až v 13 laboratóriách na overenie metódy pre extrakciu voľného tryptofánu. Každá vzorka sa analyzovala 5 krát. Výsledky sú uvedené v tejto tabuľke:

	Vzorka 4 Zmesi pšenice a sóje	Vzorka 5 Zmes pšenice a sóje (= vzorka 4) s pridaným tryptofánom (0,457g/kg)
L	12	12
n	55	60
Priemer [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [ %]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [ %]	4,71	5,11

L	=	počet laboratórií, ktoré poskytli výsledky,
n	=	počet jednotlivých výsledkov, ktoré zostali po eliminácii odľahlých hodnôt (určené Cochranovým, Dixonovým testom na odľahlé hodnoty),
sr	=	smerodajná odchýlka opakovateľnosti,
SR	=	smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti,
r	=	opakovateľnosť,
R	=	reprodukovateľnosť,
CVr	=	variačný koeficient opakovateľnosti, %,
CVR	=	variačný koeficient reprodukovateľnosti, %.

Zorganizovala sa ďalšia štúdia ES vzájomného porovnania, v ktorej sa analyzovali štyri vzorky až v 7 laboratóriách s cieľom osvedčiť tryptofán pre hydrolýzu. Výsledky sú uvedené nižšie. Každá vzorka sa analyzovala 5 krát.

	Vzorka 1 Kŕmna zmes pre ošípané (CRM 117)	Vzorka 2 Rybia múčka s nízkym obsahom tuku (CRM 118)	Vzorka 3 Sójová múčka (CRM 119)	Vzorka 4 Sušené odstredené mlieko (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Priemer [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [ %]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [ %]	1,48	4,69	4,11	4,22

L	=	počet laboratórií, ktoré poskytli výsledky,
n	=	počet jednotlivých výsledkov, ktoré zostali po eliminácii odľahlých hodnôt (určené Cochranovým, Dixonovým testom na odľahlé hodnoty),
sr	=	smerodajná odchýlka opakovateľnosti,
SR	=	smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti,
r	=	opakovateľnosť,
R	=	reprodukovateľnosť,
CVr	=	variačný koeficient opakovateľnosti, %,
CVR	=	variačný koeficient reprodukovateľnosti, %.

9.   Poznámky

9.1.

Dodržanie špeciálnych chromatografických podmienok môže viesť k lepšiemu oddeleniu tryptofánu od α-metyl-tryptofánu. Izokratické eluovanie, po ktorom nasleduje gradientové čistenie kolóny: Kolóna na kvapalinovú hromatografiu: 125 mm × 4 mm, s náplňou C18, 5 μm alebo ekvivalentná Teplota kolóny: 32 oC Mobilná fáza: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95+5 (V+V). B: metanol Gradientový program: 0 min 100 % A 0 % B   15 min 100 % A 0 % B   17 min 60 % A 40 % B   19 min 60 % A 40 % B   21 min 100 % A 0 % B   33 min 100 % A 0 % B Prietoková rýchlosť: 1,2 ml/min. Celkový čas analýzy: približne 33 min.

9.2.

Chromatografia sa mení v závislosti od typu HPLC a od použitej náplne kolóny. Zvolený systém musí umožňovať rozlíšenie na základnú čiaru medzi tryptofánom a vnútorným štandardom. Okrem toho je dôležité, aby sa produkty degradácie dobre oddelili od tryptofánu a vnútorného štandardu. Hydrolyzáty bez vnútorného štandardu sa musia analyzovať na kontrolu základnej čiary pod vnútorným štandardom na prítomnosť nečistôt. Je dôležité, aby bol čas analýzy dostatočne dlhý na elúciu všetkých produktov degradácie, inak môžu oneskorene eluujúce píky interferovať s nasledujúcim chromatografickým dejom. V pracovnom rozsahu chromatografický systém má dávať lineárnu odozvu. Lineárna odozva sa meria konštantnou (bežnou) koncentráciou vnútorného štandardu a meniacimi sa koncentráciami tryptofánu. Je dôležité, aby rozmery oboch píkov tryptofánu aj vnútorného štandardu spadali do lineárneho rozsahu HPLC/fluorescenčného systému. Ak je jeden z píkov – tryptofánu a/alebo vnútorného štandardu – príliš malý alebo príliš veľký, analýzu treba zopakovať s inou navážkou vzorky a/alebo so zmeneným konečným objemom.

9.3.	Hydroxidy bárnatý Čím je hydroxid bárnatý starší, tým sa ťažšie rozpúšťa. Výsledkom je nečíry roztok na stanovenie HPLC, ktorý môže viesť k nízkym výsledným hodnotám tryptofánu.

H.   STANOVENIE OLEJOV A TUKOV

1.   Účel a oblasť

Táto metóda je určená na stanovenie olejov a tukov v krmivách. Nevzťahuje sa na analýzu olejnatých semien a olejnatých plodov.

Použitie týchto dvoch nižšie uvedených postupov závisí od charakteru a zloženia krmív a dôvodu, prečo sa analýza vykonáva.

1.1.   Postup A – priamo extrahovateľné oleje a tuky

Táto metóda sa uplatňuje na kŕmne suroviny rastlinného pôvodu okrem tých, na ktoré sa vzťahuje postup B.

1.2.   Postup B – celkové oleje a tuky

Táto metóda sa uplatňuje na kŕmne suroviny živočíšneho pôvodu a na všetky kŕmne zmesi. Používa sa aj pri všetkých materiáloch, z ktorých sa oleje a tuky nedajú úplne vyextrahovať bez predchádzajúcej hydrolýzy (napr. glutény, kvasnice, zemiakové bielkoviny a produkty, ktoré boli spracované postupom ako extrúzia, vločkovanie a zahrievanie).

1.3.   Interpretácia výsledkov

Vo všetkých prípadoch, keď sa postupom B dosiahne vyšší výsledok ako postupom A, sa za správnu hodnotu považuje výsledok získaný postupom B.

2.   Podstata metódy

2.1.   Postup A

Vzorka sa extrahuje petroléterom. Rozpúšťadlo sa oddestiluje a zvyšok sa vysuší a odváži.

2.2.   Postup B

Vzorka sa upravuje kyselinou chlorovodíkovou za varu. Zmes sa ochladí a prefiltruje. Zvyšok sa premýva a vysuší a postúpi na stanovenie podľa postupu A.

3.   Chemikálie

3.1.	Petroléter, rozpätie bodu varu: 40 až 60 oC. Hodnota brómového čísla musí byť nižšia ako 1 a zvyšok po odparení menej ako 2 mg/100 ml.

3.2.	Síran sodný, bezvodý.

3.3.	Kyselina chlorovodíková, c = 3 mol/l

3.4.	Filtračná pomôcka, napr. Kieselguhr, Hyflo-supercel.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Prístroj na extrakciu. Ak je vybavený sifónom (Soxhletov prístroj), prietoková rýchlosť musí byť taká, aby vykazovala 10 cyklov za hodinu; ak ide o zariadenie bez sifónu, prietoková rýchlosť musí byť 10 ml za minútu.

4.2.	Extrakčné patróny, ktoré neobsahujú látky rozpustné v petroléteri a ktoré majú priepustnosť v súlade s požiadavkami bodu 4.1.

4.3.	Sušiareň, buď vákuová nastavená na 75 ± 3 oC, alebo vzduchová nastavená na 100 ± 3 oC.

5.   Postup

5.1.   Postup A (pozri bod 8.1)

Navážte 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg, preneste ju do extrakčnej patróny (4.2) a prikryte kúskom beztukovej vaty.

Vložte patrónu do extraktora (4.1) a extrahujte šesť hodín petroléterom (3.1). Zachyťte extrakt petroléteru v suchej odváženej banke s obsahom zrniečok pemzy (2).

Oddestilujte rozpúšťadlo. Sušte zvyšok, ktorý zostal v banke, jeden a pol hodiny v sušiarni (4.3). Nechajte vychladnúť v exsikátore a odvážte. Opäť sušte 30 minút, čím sa zabezpečí, že hmotnosť olejov a tukov zostane konštantná (strata hmotnosti medzi dvomi po sebe nasledujúcimi váženiami musí byť menšia alebo rovná 1 mg).

5.2.   Postup B

Navážte 2,5 g vzorky s presnosťou na 1 mg (pozri bod 8.2), vložte do 400 ml kadičky alebo do 300 ml Erlenmayerovej banky a pridajte 100 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.3) a zrniečka pemzy. Kadičku prikryte hodinovým sklíčkom alebo na Erlenmayerovu banku nasaďte spätný chladič. Uveďte zmes do mierneho varu na slabom ohni alebo vyhrievacej platni a varte jednu hodinu. Zabráňte prilepeniu vzorky na steny nádobky.

Ochlaďte a pridajte také množstvo filtračnej pomôcky (3.4), ktoré bude dostatočné na zabránenie akýmkoľvek stratám oleja a tuku počas filtrácie. Prefiltrujte cez navlhčený, beztukový, dvojitý filtračný papier. Zvyšok premývajte studenou vodou, kým nezískate neutrálny filtrát. Skontrolujte, či filtrát neobsahuje oleje a tuky. Ich prítomnosť znamená, že sa vzorka pred hydrolýzou musí extrahovať petroléterom podľa postupu A.

Položte dvojitý filtračný papier obsahujúci zvyšok na hodinové sklíčko a sušte jeden a pol hodiny vo vzduchovej sušiarni (4.3) pri teplote 100 oC ± 3 oC.

Vložte dvojitý filtračný papier obsahujúci suché zvyšky do extrakčnej patróny (4.2) a prikryte kúskom beztukovej vaty. Patrónu vložte do extraktora (4.1) a postupujte tak, ako je uvedené v druhom a treťom odseku bodu 5.1.

6.   Vyjadrenie výsledkov

Vyjadrite hmotnosť zvyšku ako percento zo vzorky.

7.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení uskutočnených z tej istej vzorky tým istým analytikom nesmie presiahnuť:

—	0,2 % v absolútnej hodnote pre obsahy olejov a tukov pod 5 %,

—	4,0 % relatívnych z hodnoty vyššieho výsledku pri obsahoch od 5 do 10 %,

—	0,4 % v absolútnej hodnote pre obsahy nad 10 %.

8.   Poznámky

8.1.

Pri produktoch s vysokým obsahom olejov a tukov, ktoré sa obtiažne drvia alebo sú nevhodné na získanie homogénnej redukovanej skúšobnej vzorky, postupujte podľa tohto postupu: Navážte 20 g vzorky s presnosťou na 1 mg a zmiešajte s 10 alebo viac gramami bezvodého síranu sodného (3.2). Extrahujte petroléterom (3.1) podľa bodu 5.1. Získaný extrakt doplňte na 500 ml petroléterom (3.1) a premiešajte. Odoberte 50 ml roztoku a vložte do malej, suchej, odváženej banky obsahujúcej zrniečka pemzy. Rozpúšťadlo oddestilujte, vysušte a postupujte spôsobom uvedeným v poslednom odseku bodu 5.1. Odstráňte rozpúšťadlo z extrakčného zvyšku, ktorý zostal v patróne, zvyšok rozdrvte na jemnosť 1 mm, vráťte do extrakčnej patróny (nepridávajte síran sodný) a postupujte spôsobom uvedeným v druhom a treťom odseku bodu 5.1. Vypočítajte obsah olejov a tukov ako percento vzorky s pomocou tohto vzorca: (10 m1 + m2) × 5 kde: m1 = hmotnosť zvyšku v gramoch po prvej extrakcii (alikvotná časť extraktu), m2 = hmotnosť zvyšku v gramoch po druhej extrakcii.

8.2.	V prípade produktov s nízkym obsahom olejov a tukov sa môže množstvo skúšobnej vzorky zvýšiť na 5 g.

8.3.	V prípade krmív pre spoločenské zvieratá s vysokým obsahom vody sa môže stať, že ich bude treba zmiešať s bezvodým síranom sodným ešte pred hydrolýzou a extrakciou podľa postupu B.

8.4.	V odseku 5.2 môže byť na premytie zvyšku po filtrácii efektívnejšie použiť horúcu vodu namiesto studenej.

8.5.	V prípade niektorých krmív môže byť potrebné 1,5 hodinovú dobu sušenia predĺžiť. Vyhnite sa nadmernému sušeniu, keďže to môže viesť k nízkym výsledným hodnotám. Je možné použiť aj mikrovlnnú rúru.

8.6.	Ak je obsah oleja/tuku vyšší ako 15 %, tak sa odporúča predbežná extrakcia podľa postupu A pred hydrolýzou a reextrakcia podľa postupu B. Závisí to do určitej miery od charakteru krmiva a od charakteru oleja/tuku v krmive.

I.   STANOVENIE VLÁKNINY

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť beztukové organické látky v krmivách, ktoré sú nerozpustné v kyslom a zásaditom prostredí a bežne sa označujú ako vláknina.

2.   Podstata metódy

Vzorka, v prípade potreby odtučnená, sa postupne rozkladá vriacimi roztokmi kyseliny sírovej a hydroxidu draselného v predpísaných koncentráciách. Zvyšok sa oddelí filtráciou na sklenenej frite, premyje, vysuší, odváži a spopolní pri teplote 475 až 500 oC. Úbytok hmotnosti v dôsledku spopolnenia zodpovedá vláknine prítomnej v skúšobnej vzorke.

3.   Chemikálie

3.1.	Kyselina sírová, c = 0,13 mol/l

3.2.	Protipeniace činidlo (napr. n-oktanol)

3.3.	Filtračná pomôcka (Celit 545 alebo ekvivalentná) žíhaná 4 hodiny pri teplote 500 oC (8.6)

3.4.

Acetón

3.5.	Petroléter s rozpätím bodu varu od 40 do 60 oC

3.6.	Kyselina chlorovodíková, c = 0,5 mol/l

3.7.	Roztok hydroxidu draselného c = 0,23 mol/l

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.

Vyhrievacia jednotka určená na rozklad kyselinou sírovou a roztokom hydroxidu draselného vybavená držiakom na filtračný téglik (4.2) a výstupnou rúrkou s kohútom na vypustenie kvapaliny a vákua, podľa možnosti so stlačeným vzduchom. Pred použitím jednotku každý deň predhrievajte vriacou vodou počas piatich minút.

4.2.	Sklenený filtračný téglik so sklenenou filtračnou fritou s veľkosťou pórov 40 – 90 μm. Pred prvým použitím žíhajte niekoľko minút pri teplote 500 oC a nechajte vychladnúť (8.6).

4.3.	Valec s objemom najmenej 270 ml so spätným chladičom, vhodný na varenie.

4.4.	Sušiareň s termostatom.

4.5.	Muflová pec s termostatom.

4.6.	Extrakčná jednotka s podpornou platňou na filtračný téglik (4.2) a vypúšťacím potrubím s kohútom na uvoľňovanie vákua a vypúšťanie kvapaliny.

4.7.	Spojovacie krúžky na spájanie vyhrievacej jednotky (4.1), téglika (4.2) a valca (4.3) a na pripojenie jednotky na extrakciu za studena (4.6) a téglika.

5.   Postup

Navážte 1 g pripravenej vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte do téglika (4.2) (pozri poznámky 8.1, 8.2 a 8.3) a pridajte 1 g filtrovacej pomôcky (3.3).

Spojte vyhrievaciu jednotku (4.1) a filtračný téglik (4.2), potom pripojte k tégliku valec (4.3). Nalejte 150 ml vriacej kyseliny sírovej (3.1) do valca spojeného s téglikom a v prípade potreby pridajte niekoľko kvapiek protipeniaceho činidla (3.2).

Uveďte tekutinu do varu v priebehu 5 ± 2 minút a prudko varte po dobu presne 30 minút.

Otvorte kohút na vypúšťacom potrubí (4.1) a vo vákuu filtrujte kyselinu sírovú cez filtračný téglik a zvyšok premyte tromi po sebe nasledujúcimi 30 ml dávkami vriacej vody. Presvedčte sa, že zvyšok je prefiltrovaný po každom premytí dosucha.

Zatvorte výpustný kohút a nalejte 150 ml vriaceho roztoku hydroxidu draselného (3.7) do valca spojeného s téglikom a pridajte niekoľko kvapiek protipeniaceho činidla (3.2). Uveďte tekutinu do varu v priebehu 5 ± 2 minút a prudko varte po dobu presne 30 minút. Prefiltrujte a zopakujte postup premývania použitý pri kroku s kyselinou sírovou.

Po poslednom premytí a vysušení odpojte téglik a jeho obsah a znovu pripojte k jednotke na extrakciu za studena (4.6). Vytvorte vákuum a premyte zvyšok v tégliku tromi po sebe nasledujúcimi 25 ml dávkami acetónu (3.4) a presvedčte sa, či bol zvyšok po každom premytí prefiltrovaný dosucha.

Vysušte téglik na konštantnú hmotnosť v sušiarni pri teplote 130 oC. Po každom vysušení nechajte vychladnúť v exsikátore a rýchlo odvážte. Umiestnite téglik do muflovej pece a spopolňujte na konštantnú hmotnosť (strata hmotnosti medzi dvoma po sebe nasledujúcimi váženiami musí byť nižšia alebo rovná 2 mg) pri teplote 475 oC až 500 oC po dobu najmenej 30 minút.

Po každom zahriatí najskôr nechajte vychladnúť v peci a potom v exsikátore pred vážením.

Vykonajte slepý pokus bez vzorky. Strata hmotnosti v dôsledku spopolňovania nesmie presiahnuť 4 mg.

6.   Výpočet výsledkov

Obsah vlákniny ako percento vzorky je daný týmto vzorcom:

kde:

m	=	hmotnosť vzorky v g,
m0	=	strata hmotnosti po spopolnení počas stanovenia, v g,
m1	=	strata hmotnosti po spopolnení počas slepého pokusu, v g.

7.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi dvoma paralelnými stanoveniami vykonanými v tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

—	0,6 % v absolútnej hodnote pre obsah vlákniny nižší ako 10 %,

—	6 % relatívnych z hodnoty vyššieho výsledku pre obsah vlákniny 10 % alebo vyšší ako 10 %.

8.   Poznámky

8.1.

Krmivá obsahujúce viac ako 10 % tuku sa musia pred analýzou odtučniť petroléterom (3.5). Pripojte filtračný téglik (4.2) s obsahom k jednotke na extrakciu za studena (4.6) a vytvorte vákuum, premyte zvyšok tromi po sebe nasledujúcimi 30 ml dávkami petroléteru, pričom sa presvedčte, či je zvyšok suchý. Pripojte téglik s obsahom k vyhrievacej jednotke (4.1) a postupujte ďalej podľa bodu 5.

8.2.

Krmivá obsahujúce tuky, ktoré sa nedajú priamo vyextrahovať petroléterom (3.5), sa musia odtučniť postupom uvedeným v bode 8.1 a opätovne odtučniť po varení s kyselinou. Po varení s kyselinou a následnom premytí pripojte téglik s obsahom k jednotke na extrakciu za studena (4.6) a premyte tri razy 30 ml dávkami acetónu a následne tri razy 30 ml dávkami petroléteru. Filtrujte vo vákuu do sucha a pokračujte v analýze postupom opísaným v bode 5, počnúc varom s hydroxidom draselným.

8.3.

Ak krmivá obsahujú viac ako 5 % uhličitanov, vyjadrených ako uhličitan vápenatý, tak pripojte téglik (4.2) s naváženou vzorkou k vyhrievacej jednotke (4.1). Premyte vzorku trikrát 30 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.6). Po každom prídavku nechajte vzorku asi jednu minútu stáť predtým, ako ju prefiltrujete. Premyte jedenkrát 30 ml vody a ďalej postupujte podľa bodu 5.

8.4.	Ak sa použije prístroj vo forme stojana (niekoľko téglikov pripojených k tej istej vyhrievacej jednotke) v rámci tej istej sady sa nesmú vykonať dve samostatné stanovenia s použitím tej istej analyzovanej vzorky.

8.5.	Ak je po prevarení obtiažne prefiltrovať kyslé a zásadité roztoky, použite stlačený vzduch cez vypúšťacie potrubie vyhrievacej jednotky a potom pokračujte vo filtrovaní.

8.6.	Teplota pri spopolňovaní nemá byť vyššia ako 500 oC, aby sa predĺžila životnosť sklenených filtračných téglikov. Je potrebné vyhnúť sa nadmernému tepelnému šoku počas cyklov zahrievania a chladenia.

J.   STANOVENIE CUKROV

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie množstva redukujúcich cukrov a celkových cukrov po inverzii, vyjadrených ako glukóza, alebo v prípade, že je to vhodné, ako sacharóza, po vynásobení faktorom 0,95. Uplatňuje sa v prípade kŕmnych zmesí. Pre iné krmivá platia osobitné metódy. V prípade potreby sa laktóza stanoví oddelene a zohľadní sa pri výpočte výsledkov.

2.   Podstata metódy

Cukry sa extrahujú v rozriedenom etanole; roztok sa vyčíri Carrezovými činidlami I a II. Po eliminácii etanolu sa množstvá stanovujú pred inverziou a po nej Luff-Schoorlovou metódou.

3.   Chemikálie

3.1.	Roztok etanolu 40 % (v/v) o hustote: 0,948 g/ml pri 20 oC, zneutralizovaný na indikátor fenolftaleín.

3.2.	Carrezovo činidlo I: rozpustite vo vode 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého Zn(CH3COO)2 2H2O a 3 g ľadovej kyseliny octovej. Doplňte objem vodou na 100 ml.

3.3.	Carrezovo činidlo II: rozpustite vo vode 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného, K4 Fe (CN)6 3H2O. Doplňte objem vodou na 100 ml.

3.4.	Metyloranž, roztok 0,1 % (w/v).

3.5.	Kyselina chlorovodíková 4 mol/liter.

3.6.	Kyselina chlorovodíková 0,1 mol/liter.

3.7.	Roztok hydroxidu sodného 0,1 mol/liter.

3.8.

Luff-Schoorlovo činidlo: Za opatrného miešania nalejte roztok kyseliny citrónovej (3.8.2) do roztoku uhličitanu sodného (3.8.3). Pridajte roztok síranu meďnatého (3.8.1) a objem doplňte vodou na 1 liter. Nechajte cez noc odstáť a prefiltrujte. Skontrolujte koncentráciu takto získaného činidla (Cu 0,05 mol/liter; Na2 CO3 1 mol/liter), pozri (5.4) posledný odsek. Hodnota pH roztoku má byť približne 9,4.

3.8.1.

Roztok síranu meďnatého: rozpustite 25 g pentahydrátu síranu meďnatého Cu SO4 5H2O, bez obsahu železa v 100 ml vody.

3.8.2.

Roztok kyseliny citrónovej: rozpustite 50 g monohydrátu kyseliny citrónovej, C6H8O7 H2O v 50 ml vody.

3.8.3.

Roztok uhličitanu sodného: rozpustite 143,8 g bezvodého uhličitanu sodného v približne 300 ml teplej vody. Nechajte vychladnúť.

3.9.	Roztok tiosíranu sodného 0,1 mol/liter.

3.10.

Roztok škrobu: pridajte zmes 5 g škrobu rozpusteného v 30 ml vody do 1 litra vriacej vody. Varte tri minúty, nechajte vychladnúť a v prípade potreby pridajte 10 mg jodidu ortutnatého na konzervovanie.

3.11.

Kyselina sírová, 3 mol/liter.

3.12.

Jodid draselný, roztok 30 % (w/v).

3.13.

Granulovaná pemza vyvarená v kyseline chlorovodíkovej, premytá vodou a vysušená.

3.14.

3-metylbutan-1-ol.

4.   Prístrojové vybavenie

Mixér (trepačka): približne 35 až 40 ot/min.

5.   Postup

5.1.   Extrakcia vzorky

Navážte 2,5 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte do odmernej banky s objemom 250 ml. Pridajte 200 ml etanolu (3.1) a hodinu miešajte v trepačke. Pridajte 5 ml Carrezovho činidla I (3.2) a miešajte približne 30 sekúnd. Pridajte 5 ml Carrezovho činidla II (3.3) a miešajte približne jednu minútu. Doplňte etanolom po značku (3.1), zhomogenizujte a prefiltrujte. Napipetujte 200 ml filtrátu a odparte na približne polovičný objem, aby sa odstránilo čo najväčšie množstvo etanolu. Zvyšok po odparení kvantitatívne preneste do 200 ml odmernej banky pomocou horúcej vody, nechajte vychladnúť, doplňte po značku vodou, zhomogenizujte a v prípade potreby prefiltrujte. Roztok sa použije na stanovenie množstva redukujúcich cukrov a po inverzii na stanovenie celkových cukrov.

5.2.   Stanovenie redukujúcich cukrov

Pomocou pipety odoberte najviac 25 ml roztoku obsahujúceho menej ako 60 mg redukujúcich cukrov vyjadrených ako glukóza. V prípade potreby objem doplňte destilovanou vodou na 25 ml a stanovte obsah redukujúcich cukrov Luff-Schoorlovou metódou. Výsledok sa vyjadrí ako percentuálny obsah glukózy vo vzorke.

5.3.   Stanovenie celkových cukrov po inverzii

Do 100 ml odmernej banky napipetujte 50 ml roztoku. Pridajte niekoľko kvapiek roztoku metyloranže (3.4), potom za stáleho miešania opatrne pridávajte kyselinu chlorovodíkovú (3.5), až do vzniku cibuľového zafarbenia. Pridajte 15 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.6), banku ponorte do kúpeľa s vriacou vodou a nechajte v ňom tridsať minút. Rýchlo ochlaďte na približne 20 oC a pridajte 15 ml roztoku hydroxidu sodného (3.7). Doplňte objem vodou na 100 ml a zhomogenizujte. Odoberte najviac 25 ml s obsahom menej ako 60 mg redukujúcich cukrov vyjadrených ako glukóza. V prípade potreby objem doplňte destilovanou vodou na 25 ml a stanovte obsah redukujúcich cukrov Luff-Schoorlovou metódou. Výsledok sa vyjadruje ako percento glukózy alebo, v prípade potreby, sacharózy vynásobením faktorom 0,95.

5.4.   Titrácia Luff-Schoorlovou metódou

Do 300 ml Erlenmeyerovej banky napipetujte 25 ml Luff-Schoorlovho činidla (3.8); pridajte presne 25 ml vyčíreného roztoku cukru. Pridajte 2 granule pemzy (3.13) a zahrievajte za ručného miešania nad stredne vysokým voľným plameňom tak, aby ste kvapalinu priviedli do varu za približne dve minúty. Erlenmeyerovu banku položte okamžite na azbestom potiahnutú drôtenú sieťku s otvorom o priemere približne 6 cm, pod ktorou je zapálený plameň. Plameň sa musí regulovať tak, aby zohrieval len dno Erlenmeyerovej banky. K Erlenmeyerovej banke pripevnite spätný chladič. Varte presne desať minút. Okamžite ochlaďte v studenej vode a po približne piatich minútach titrujte takto:

Pridajte 10 ml roztoku jodidu draselného (3.12) a hneď pridajte 25 ml kyseliny sírovej (3.11) (opatrne, kvôli riziku silného penenia). Titrujte roztokom tiosíranu sodného (3.9) až do vzniku matnej žltej farby, pridajte škrobový indikátor (3.10) a dotitrujte.

Rovnakú titráciu vykonajte v presne odmeranej zmesi 25 ml Luff-Schoorlového činidla (3.8) a 25 ml vody, po pridaní 10 ml roztoku jodidu draselného (3.12) a 25 ml kyseliny sírovej (3.11) bez varu.

6.   Výpočet výsledkov

Podľa tabuľky stanovte množstvo glukózy v mg, zodpovedajúce rozdielu medzi hodnotami dvoch titrácií, vyjadrené v mg tiosíranu sodného 0,1 mol/liter. Výsledok vyjadrite ako percento vzorky.

7.   Špeciálne postupy

7.1.

Ak ide o krmivá bohaté na melasu a krmivá, ktoré nie sú celkom homogénne, tak do 1 l odmernej banky navážte 20 g vzorky a pridajte 500 ml vody. Miešajte jednu hodinu na trepačke. Vyčírte pomocou Carrezovho činidla I (3.2) a Carrezovho činidla II (3.3) podľa bodu 5.1, tento raz však použite štvornásobné množstvá z každého činidla. Doplňte po značku 80 % etanolom (v/v). Zhomogenizujte a prefiltrujte. Odstráňte etanol podľa bodu 5.1. Ak nie je prítomný žiadny dextrínovaný škrob, doplňte objem destilovanou vodou.

7.2.

Ak ide o melasu a kŕmne suroviny bohaté na cukry a neobsahujúce takmer žiadny škrob (svätojánsky chlieb, sušené repné rezky atď.), navážte 5 g vzorky, vložte do 250 ml odmernej banky, pridajte 200 ml destilovanej vody a pretrepávajte na trepačke jednu hodinu alebo v prípade potreby dlhšie. Vyčírte pomocou Carrezových činidiel I (3.2) a II (3.3) postupom opísaným v bode 5.1. Doplňte objem studenou vodou, zhomogenizujte a prefiltrujte. Obsah celkových cukrov sa stanoví podľa bodu 5.3.

8.   Poznámky

8.1.	Aby sa zabránilo peneniu, odporúča sa pred varením s Luff-Schoorlovým činidlom pridať (bez ohľadu na objem) približne 1 ml 3-metylbutan-1-olu (3.14).

8.2.	Po vynásobení rozdielu medzi obsahom celkových cukrov po inverzii, vyjadrených ako glukóza, a obsahom redukujúcich cukrov, vyjadrených ako glukóza, číslom 0,95, dostaneme percentuálny obsah sacharózy.

8.3.	Na stanovenie obsahu redukujúcich cukrov okrem laktózy sa môžu použiť dve metódy:

8.3.1.

Na približný výpočet vynásobte obsah laktózy stanovený inou analytickou metódou číslom 0,675 a odrátajte získaný výsledok z obsahu redukujúcich cukrov.

8.3.2.

Na presný výpočet redukujúcich cukrov okrem laktózy sa pre dve konečné stanovenia použije tá istá vzorka. Jedna analýza sa vykonáva na časti roztoku získaného podľa bodu 5.1, druhá na časti roztoku získaného počas procesu stanovenia laktózy metódou stanovenou na tento účel (po fermentácii ostatných typov cukru a vyčírení). V oboch prípadoch sa množstvo prítomného cukru stanovuje Luff-Schoorlovou metódou a vypočítava sa v mg glukózy. Jedna hodnota sa odráta od druhej a rozdiel sa vyjadrí ako percento vzorky. Príklad Obidva odobraté objemy zodpovedajú, pre každé stanovenie, vzorke s hmotnosťou 250 mg. V prvom prípade spotreba 17 ml roztoku tiosíranu sodného 0,1 mol/liter zodpovedá 44,2 mg glukózy; v druhom prípade spotreba 11 ml zodpovedá 27,6 mg glukózy. Rozdiel je 16,6 mg glukózy. Obsah redukujúcich cukrov (okrem laktózy) vypočítaných ako glukóza, je preto:

Tabuľka hodnôt pre 25 ml Luff-Schoorlovho činidla

ml Na2 S2 O30,1 mol/liter, pri dvojminútovom zahrievaní a 10 min. varu

Na2 S2 O3 0,1 mol/liter	Glukóza, fruktóza, invertné cukry C6 H12 O6		Laktóza C12 H22 O11		Maltóza C12 H22 O11		Na2 S2 O3 0,1 mol/liter
ml	mg	rozdiel	mg	rozdiel	mg	rozdiel	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   STANOVENIE LAKTÓZY

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah laktózy v krmivách obsahujúcich viac ako 0,5 % laktózy.

2.   Podstata metódy

Cukry sa rozpustia vo vode. Roztok sa podrobí fermentácii kvasinkami Saccharomyces cerevisiae, ktoré ponechávajú laktózu nedotknutú. Po vyčírení a prefiltrovaní sa obsah laktózy vo filtráte stanoví Luff-Schoorlovou metódou.

3.   Chemikálie

3.1.	Suspenzia kvasiniek Saccharomyces cerevisiae: rozmiešajte 25 g čerstvých kvasníc v 100 ml vody. Táto suspenzia vydrží v chladničke najviac jeden týždeň.

3.2.	Carrezovo činidlo I: rozpustite vo vode 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého Zn(CH3 COO)2 2H2O a 3 g ľadovej kyseliny octovej. Doplňte vodou na 100 ml.

3.3.	Carrezovo činidlo II: rozpustite vo vode 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného K4 Fe (CN)6 3H2O. Doplňte vodou na 100 ml.

3.4.

Luff-Schoorlovo činidlo: Za opatrného miešania nalejte roztok kyseliny citrónovej (3.4.2) do roztoku uhličitanu sodného (3.4.3). Pridajte roztok síranu meďnatého (3.4.1) a doplňte vodou na objem 1 liter. Nechajte cez noc odstáť a prefiltrujte. Skontrolujte koncentráciu takto získaného činidla (Cu 0,05 mol/liter; Na2 CO3 1 mol/liter). Hodnota pH roztoku má byť približne 9,4.

3.4.1.

Roztok síranu meďnatého: rozpustite 25 g pentahydrátu síranu meďnatého Cu SO4 5H2O neobsahujúceho železo v 100 ml vody.

3.4.2.

Roztok kyseliny citrónovej: rozpustite 50 g monohydrátu kyseliny citrónovej C6H8O7 H2O v 50 ml vody.

3.4.3.

Roztok uhličitanu sodného: rozpustite 143,8 g bezvodného uhličitanu sodného v približne 300 ml teplej vody. Nechajte vychladnúť.

3.5.	Granulovaná pemza prevarená v kyseline chlorovodíkovej, premytá vodou a vysušená.

3.6.	30 % roztok (w/v) jodidu draselného.

3.7.	Kyselina sírová, 3 mol/liter.

3.8.	Roztok tiosíranu sodného 0,1 mol/liter.

3.9.	Roztok škrobu: pridajte zmes 5 g škrobu rozpusteného v 30 ml vody do 1 litra vriacej vody. Varte tri minúty, nechajte vychladnúť a v prípade potreby pridajte 10 mg jodidu ortutnatého na konzervovanie.

4.   Prístrojové vybavenie

Vodný kúpeľ s termostatom nastaveným na 38 – 40 oC.

5.   Postup

Do 100 mil odmernej banky navážte 1 g vzorky s presnosťou na 1 mg. Pridajte 25 až 30 ml vody. Vložte banku do vriaceho vodného kúpeľa na tridsať minút a potom ochlaďte na teplotu približne 35 oC. Pridajte 5 ml suspenzie kvasiniek a zhomogenizujte. Nechajte banku dve hodiny odstáť vo vodnom kúpeli pri teplote 38 – 40 oC. Ochlaďte na teplotu približne 20 oC.

Pridajte 2,5 ml Carrezovho činidla I (3.2) a miešajte tridsať sekúnd, potom pridajte 2,5 ml Carrezovho činidla II (3.3) a opäť miešajte tridsať sekúnd. Doplňte objem vodou na 100 ml, potrepte a prefiltrujte. Množstvo filtrátu, nie väčšie ako 25 ml, ktoré obsahuje 40 až 80 mg laktózy, napipetujte do 300 ml Erlenmeyerovej banky. V prípade potreby doplňte na objem 25 ml vodou.

Rovnakým postupom vykonajte slepý pokus s 5 ml suspenzie kvasiniek (3.1). Stanovte obsah laktózy podľa Luff-Schoorla takto: pridajte presne 25 ml Luff-Schoorlovho činidla (3.4) a dve granule pemzy (3.5). Miešajte ručne počas zahrievania nad stredne vysokým voľným plameňom a kvapalinu priveďte do varu za približne dve minúty. Erlenmeyerovu banku položte okamžite na azbestom potiahnutú drôtenú sieťku s otvorom o priemere približne 6 cm, pod ktorou je zapálený plameň. Plameň sa musí regulovať tak, aby zohrieval len dno Erlenmeyerovej banky. Na Erlenmeyerovú banku nasaďte spätný chladič. Varte presne desať minút. Okamžite ochlaďte v studenej vode a po približne piatich minútach stitrujte takto:

Pridajte 10 ml roztoku jodidu draselného (3.6) a ihneď potom pridajte 25 ml kyseliny sírovej (3.7) (opatrne, kvôli riziku silného penenia). Titrujte roztokom tiosíranu sodného (3.8) až do vzniku matnej žltej farby, pridajte škrobový indikátor (3.9) a dotitrujte.

Rovnakú titráciu vykonajte v presne odmeranej zmesi 25 ml Luff-Schoorlového činidla (3.4) a 25 ml vody, po pridaní 10 ml roztoku jodidu draselného (3.6) a 25 ml kyseliny sírovej (3.7) bez varu.

6.   Výpočet výsledkov

Pomocou priloženej tabuľky stanovte množstvo laktózy v mg, zodpovedajúce rozdielu medzi výsledkami dvoch titrácií, vyjadrené v ml tiosíranu sodného 0,1 mol/liter.

Vyjadrite výsledok ako podiel bezvodej laktózy v percentách vzorky.

7.   Poznámky

Pre produkty s obsahom viac ako 40 % fermentovateľného cukru použite viac ako 5 ml suspenzie kvasiniek (3.1).

Tabuľka hodnôt pre 25 ml Luff-Schoorlovho činidla

ml Na2 S2 O30,1 mol/liter, pri dvojminútovom zahrievaní a 10 min. varu

Na2 S2 O3 0,1 mol/liter	Glukóza, fruktóza, invertné cukry C6 H12 O6		Laktóza C12 H22 O11		Maltóza C12 H22 O11		Na2 S2 O3 0,1 mol/liter
ml	mg	rozdiel	mg	rozdiel	mg	rozdiel	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

L.   STANOVENIE ŠKROBU

– POLARIMETRICKÁ METÓDA –

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanovenie obsahu škrobu a produktov degradácie škrobu s vysokou molekulovou hmotnosťou v krmivách na účely kontroly súladu s deklarovanou energetickou hodnotou (v ustanoveniach prílohy VII) a smernicou Rady 96/25/ES (3).

2.   Podstata metódy

Táto metóda pozostáva z dvoch stanovení. Pri prvom stanovení sa vzorka upraví zriedenou kyselinou chlorovodíkovou. Po vyčírení a filtrácii sa polarimetrickým meraním stanoví optická otáčavosť roztoku.

Pri druhom stanovení sa vzorka extrahuje 40 % etanolom. Po okyslení filtrátu kyselinou chlorovodíkovou, vyčírení a prefiltrovaní sa zmeria optická otáčavosť rovnakým spôsobom ako pri prvom stanovení.

Rozdiel medzi týmito dvomi meraniami, vynásobený známym faktorom udáva obsah škrobu vo vzorke.

3.   Chemikálie

3.1.	Roztok 25 % (w/v) kyseliny chlorovodíkovej, hustota: 1,126 g/ml.

3.2.	Roztok 1,13 % (w/v) kyseliny chlorovodíkovej. Koncentrácia sa musí skontrolovať titráciou s použitím roztoku hydroxidu sodného 0,1 mol/liter v prítomnosti 0,1 % (w/v) metylčervene v 94 % (v/v) etanole. Na neutralizáciu 10 ml je potrebných 30,94 ml NaOH 0,1 mol/liter.

3.3.	Carrezovo činidlo I: rozpustite vo vode 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého Zn(CH3COO)2 2H2O a 3 g ľadovej kyseliny octovej. Doplňte objem vodou na 100 ml.

3.4.	Carrezovo činidlo II: rozpustite vo vode 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného, K4Fe(CN)6 3H2O. Doplňte objem vodou na 100 ml.

3.5.	Roztok 40 % (v/v) etanolu, hustota: 0,948 g/ml pri 20 oC.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	250 ml Erlenmeyerova banka so zábrusom a so spätným chladičom

4.2.	Polarimeter alebo sacharimeter.

5.   Postup

5.1.   Príprava vzorky

Vzorku meľte dovtedy, kým nebude dostatočne jemná, aby celá prešla cez sito s okrúhlymi otvormi 0,5 mm.

5.2.   Stanovenie celkovej optickej otáčavosti (P alebo S) (pozri poznámku 7.1)

Navážte 2,5 g pomletej vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte do 100 ml odmernej banky. Pridajte 25 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.2), premiešajte tak, aby ste docielili rovnomerné rozptýlenie skúšobnej vzorky, a pridajte ďalších 25 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.2). Banku ponorte do vriaceho vodného kúpeľa, pričom ňou prvé tri minúty intenzívne a sústavne pretrepávajte, aby sa zabránilo tvorbe hrudiek. Množstvo vody vo vodnom kúpeli musí byť dostatočné na to, aby kúpeľ zostal na bode varu aj po ponorení banky do kúpeľa. Banka sa nesmie vybrať z kúpeľa počas pretrepávania. Presne po 15 minútach ju vyberte z kúpeľa, pridajte 30 ml studenej vody a ihneď ochlaďte na teplotu 20 oC.

Pridajte 5 ml Carrezovho činidla I (3.3) a pretrepávajte približne 30 sekúnd. Potom pridajte 5 ml Carrezovho činidla II (3.4) a znovu pretrepávajte približne 30 sekúnd. Doplňte na požadovaný objem vodou, premiešajte a prefiltrujte. Ak filtrát nebude dokonale číry, (čo je zriedkavé), stanovenie zopakujte s použitím väčšieho množstva Carrezových činidiel I a II, napr. 10 ml.

Zmerajte optickú otáčavosť roztoku v 200 mm trubici pomocou polarimetra alebo sacharimetra.

5.3.   Stanovenie optickej otáčavosti (P' a S') látok rozpustných v 40 % etanole

Navážte 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg, vložte do 100 ml odmernej banky a pridajte približne 80 ml etanolu (3.5) (pozri poznámku 7.2). Nechajte banku 1 hodinu odstáť pri laboratórnej teplote; počas tejto doby šesťkrát intenzívne pretrepte tak, aby sa skúšobná vzorka dôkladne premiešala s etanolom. Doplňte na požadovaný objem etanolom (3.5), premiešajte a prefiltrujte.

Do 250 ml Erlenmeyerovej banky napipetujte 50 ml filtrátu (čo zodpovedá 2,5 g vzorky), pridajte 2,1 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1) a intenzívne pretrepte. Na Erlenmeyerovu banku nasaďte spätný chladič a banku ponorte do vriaceho vodného kúpeľa. Presne po 15 minútach Erlenmeyerovu banku z kúpeľa vyberte, obsah preneste do 100 ml odmernej banky, prepláchnite malým množstvom studenej vody a ochlaďte na teplotu 20 oC.

Vyčírte použitím Carrezových činidiel I (3.3) a II (3.4), doplňte na požadovaný objem vodou, premiešajte, prefiltrujte a zmerajte optickú otáčavosť spôsobom uvedeným v druhom a treťom odseku bodu 5.2.

6.   Výpočet výsledkov

Obsah škrobu (%) sa vypočíta takto:

6.1.   Meranie polarimetrom

P	=	celková optická otáčavosť v uhlových stupňoch,
P'	=	optická otáčavosť v uhlových stupňoch látok rozpustných v 40 % (V/V) etanole,
	=	špecifická optická otáčavosť čistého škrobu. Číselné hodnoty bežne akceptované pre tento faktor sú: + 185,9o: ryžový škrob, + 185,7o: zemiakový škrob, + 184,6o: kukuričný škrob, + 182,7o: pšeničný škrob, + 181,5o: jačmenný škrob, + 181,3o: ovsený škrob, + 184,0o: ostatné druhy škrobov a zmesi škrobov v kŕmnych zmesiach.

6.2.   Meranie sacharimetrom

S	=	celková optická otáčavosť v sacharometrických stupňoch,
S'	=	optická otáčavosť v sacharometrických stupňoch látok rozpustných v 40 % (v/v) etanole,
N	=	hmotnosť (g) sacharózy v 100 ml vody poskytujúca optickú otáčavosť 100 sacharometrických stupňov pri meraní pomocou 200 mm trubice, 16,29 g pre francúzske sacharimetre, 26,00 g pre nemecké sacharimetre, 20,00 g pre zmiešané sacharimetre,
	=	špecifická optická otáčavosť čistého škrobu (pozri bod 6.1).

6.3.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v rovnakej vzorke nesmie presiahnuť 0,4 v absolútnej hodnote pre obsah škrobu menší ako 40 % a 1 % relatívnych pre obsah škrobu rovný alebo väčší ako 40 %.

7.   Poznámky

7.1.	Ak vzorka obsahuje viac ako 6 % uhličitanov, vypočítaných ako uhličitan vápenatý, tieto sa musia rozložiť pred stanovením celkovej optickej otáčavosti presne známym množstvom zriedenej kyseliny sírovej.

7.2.

Ak ide o produkty s vysokým obsahom laktózy, ako je sušené mliečne sérum alebo sušené odstredené mlieko, postupujte po pridaní 80 ml etanolu (3.5) takto: na Erlenmeyerovu banku nasaďte spätný chladič a banku ponorte na 30 minút do vodného kúpeľa s teplotou 50 oC. Nechajte vychladnúť a pokračujte v analýze podľa bodu 5.3.

7.3.

Ak sú nasledovné kŕmne suroviny prítomné vo významnom množstve v krmivách, je známe, že spôsobujú interferencie pri stanovovaní obsahu škrobu polarimetrickou metódou, čo môže viesť k nesprávnym výsledkom: — produkty z (cukrovej) repy, ako dužina z (cukrovej) repy, melasa z (cukrovej) repy, dužina z (cukrovej) repy – melasová, vinas z (cukrovej) repy, (repný) cukor, — citrusová dužina, — ľanové semeno; ľanové výlisky; ľanový extrahovaný šrot, — repkové semeno; repkové výlisky; repkový extrahovaný šrot; šupky repkového semena, — slnečnicové semeno; slnečnicový extrahovaný šrot; slnečnicový extrahovaný šrot z čiastočne lúpaných semien, — výlisky z kopry; extrahovaný šrot z kopry, — zemiaková dužina, — dehydrované kvasnice, — produkty bohaté na inulín (napríklad rezky a múčka z topinamburu), — oškvarky.

M.   STANOVENIE POPOLA

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah popola v krmivách.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa spopolní pri teplote 550 oC, zvyšok sa odváži.

3.   Chemikálie

20 % roztok (w/v) dusičnanu amónneho.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Vyhrievacia platňa

4.2.	Elektrická muflová pec s termostatom.

4.3.	Spaľovacie tégliky vyrobené z kremeňa, porcelánu alebo platiny buď obdĺžnikové (približne 60 × 40 × 25 mm), alebo valcovité (s priemerom: 60 až 75 mm, s výškou: 20 až 40 mm).

5.   Postup

Navážte s presnosťou na 1 mg približne 5 g vzorky (2,5 g v prípade, že ide o produkty, ktoré majú tendenciu napučiavať) a vložte do spaľovacieho téglika, ktorý ste vopred vyžíhali na 550 oC, nechali ochladiť a odvážili. Položte téglik na vyhrievaciu platňu a postupne zohrievajte až do zuhoľnatenia vzorky. Spopolňujte podľa bodu 5.1 alebo 5.2.

5.1.	Téglik vložte do kalibrovanej muflovej pece nastavenej na teplotu 550 oC. Túto teplotu udržiavajte až do získania bieleho, bledosivého alebo červenkastého popola, bez obsahu uhlíkatých častíc. Vložte téglik do exsikátora, nechajte vychladnúť a okamžite odvážte.

5.2.

Téglik vložte do kalibrovanej muflovej pece vyhriatej na 550 oC. Spopolňujte 3 hodiny. Vložte téglik do exsikátora, nechajte vychladnúť a okamžite odvážte. Opäť spopolňujte 30 minút, čím sa zabezpečí, že hmotnosť popola zostane konštantná (strata hmotnosti medzi dvoma po sebe nasledujúcimi váženiami musí byť najviac 1 mg).

6.   Výpočet výsledkov

Hmotnosť zvyšku vypočítajte odpočítaním hmotnosti téglika.

Výsledok vyjadrite ako percento vzorky.

7.   Poznámky

7.1.

Látky, ktoré sa ťažko spopolňujú, sa najskôr musia spopolňovať najmenej tri hodiny, ochladiť a potom sa k popolu pridá niekoľko kvapiek 20 % roztoku dusičnanu amónneho (opatrne, aby sa zabránilo rozptýleniu popola alebo tvorbe hrudiek). Po vysušení v sušiarni pokračujte v žíhaní. Postup podľa potreby opakujte dovtedy, kým nebude spopolnenie ukončené.

7.2.

Ak ide o látky odolné voči úprave opísanej v bode 7.1, postupujte takto: po trojhodinovom spopolňovaní vložte popol do teplej vody a prefiltrujte cez malý bezpopolový filter. Filter a jeho obsah spopolnite v pôvodnom tégliku. Filtrát vložte do vychladnutého téglika, odparte do sucha, spopolnite a odvážte.

7.3.	V prípade olejov a tukov presne navážte 25 g vzorky do téglika vhodnej veľkosti. Zuhoľňujte pod lampou nastavenou na vzorku a pomocou pásika bezpopolového filtračného papiera. Po spálení zvlhčite čo možno najmenším množstvom vody. Vysušte a spopolnite postupom uvedenom v bode 5.

N.   STANOVENIE OBSAHU POPOLA, KTORÝ JE NEROZPUSTNÝ V KYSELINE CHLOROVODÍKOVEJ

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť v krmivách obsah minerálnych látok, ktoré sú nerozpustné v kyseline chlorovodíkovej. V závislosti od druhu vzorky sa môžu použiť dve metódy.

1.1.	Metóda A: uplatniteľná na kŕmne suroviny organického pôvodu a na väčšinu kŕmnych zmesí.

1.2.	Metóda B: uplatniteľná na minerálne zlúčeniny a zmesi a na kŕmne zmesi, v ktorých je obsah látok nerozpustných v kyseline chlorovodíkovej, stanovený metódou A, väčší ako 1 %.

2.   Podstata metódy

2.1.	Metóda A: vzorka sa spopolní, popol sa uvarí v kyseline chlorovodíkovej a nerozpustný zvyšok sa prefiltruje a odváži.

2.2.	Metóda B: na vzorku sa pôsobí kyselinou chlorovodíkovou. Roztok sa prefiltruje, zvyšok sa spopolní a takto získaný popol sa spracuje podľa metódy A.

3.   Chemikálie

3.1.	Kyselina chlorovodíková 3 mol/liter.

3.2.	20 % roztok (w/v) kyseliny trichlóroctovej.

3.3.	1 % roztok (w/v) kyseliny trichlóroctovej.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Vyhrievacia platňa.

4.2.	Elektrická muflová pec s termostatom.

4.3.	Spaľovacie tégliky vyrobené z kremeňa, porcelánu alebo platiny buď obdĺžnikové (približne 60 × 40 × 25 mm), alebo valcovité (s priemerom: 60 až 75 mm, s výškou: 20 až 40 mm).

5.   Postup

5.1.   Metóda A

Vzorku spopolnite postupom opísaným pri stanovení popola. Môže sa použiť aj popol získaný takou analýzou.

Popol vložte do 250 až 400 ml kadičky pomocou 75 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1). Pomaly priveďte do varu a nechajte mierne vrieť 15 minút. Teplý roztok prefiltrujte cez bezpopolový filtračný papier a zvyšok premývajte teplou vodou, až do odstránenia kyslej reakcie. Filter so zvyškom vysušte a spopolnite v odváženom tégliku pri teplote najmenej 550 oC a najviac 700 oC. Nechajte vychladnúť v exsikátore a odvážte.

5.2.   Metóda B

Navážte 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte do 250 až 400 ml kadičky. Pridajte 25 ml vody a následne 25 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1), premiešajte a počkajte, kým neprestane šumieť. Pridajte ďalších 50 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1). Počkajte, kým sa prestane uvoľňovať akýkoľvek plyn, potom kadičku vložte do vriaceho vodného kúpeľa na tridsať minút, prípadne na dlhšie, aby sa dôkladne zhydrolyzoval všetok prítomný škrob. Prefiltrujte ešte za tepla cez bezpopolový filter a filter premyte 50 ml teplej vody (pozri poznámku 7). Filter so zvyškom vložte do spaľovacieho téglika, vysušte a spopolnite pri teplote najmenej 550 oC a najviac 700 oC. Popol vložte do 250 až 400 ml kadičky pomocou 75 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1); pokračujte postupom opísaným v druhom pododseku bodu 5.1.

6.   Výpočet výsledkov

Hmotnosť zvyšku vypočítajte odpočítaním hmotnosti téglika. Výsledok vyjadrite ako percento vzorky.

7.   Poznámky

Ak je filtrácia obtiažna, začnite analýzu znova, pričom 50 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1) nahraďte 50 ml 20 % kyseliny trichlóroctovej (3.2) a filter premyte teplým roztokom 1 % kyseliny trichlóroctovej (3.3).

O.   STANOVENIE UHLIČITANOV

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť množstvo uhličitanov, všeobecne vyjadrené ako uhličitan vápenatý vo väčšine krmív.

V určitých prípadoch sa musí použiť špeciálna metóda (napr. ak ide o uhličitany železa).

2.   Podstata metódy

Uhličitany sa rozložia v kyseline chlorovodíkovej; uvoľnený oxid uhličitý sa zachytí do odmernej skúmavky a jeho objem sa porovná s objemom uvoľneným za tých istých podmienok zo známeho množstva uhličitanu vápenatého.

3.   Chemikálie

3.1.	Kyselina chlorovodíková, hustota c = 1,10 g/ml.

3.2.	Uhličitan vápenatý.

3.3.	Kyselina sírová, približne 0,05 mol/liter, zafarbená metylčerveňou.

4.   Prístrojové vybavenie

Scheibler-Dietrichov prístroj (pozri obrázok) alebo ekvivalentný prístroj.

5.   Postup

Podľa obsahu uhličitanu vo vzorke navážte časť vzorky takto:

—	0,5 g, ak ide o produkty obsahujúce od 50 do 100 % uhličitanov vyjadrených ako uhličitan vápenatý,

—	1 g, ak ide o produkty obsahujúce od 40 do 50 % uhličitanov vyjadrených ako uhličitan vápenatý,

—	2 až 3 g, ak ide o ostatné produkty.

Vložte naváženú vzorku do špeciálnej banky (4) prístroja, opatrenej malou trubičkou z nerozbitného materiálu obsahujúcou 10 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1), a banku pripojte k prístroju. Otočte trojcestný kohút (5) tak, aby trubička (1) bola spojená s vonkajškom. Mobilnou trubičkou (2), naplnenou zafarbenou kyselinou sírovou (3.3) a spojenou s odmernou skúmavkou (1), nastavte hladinu kvapaliny na značku nula. Otočte kohútom (5) tak, aby sa trubičky (1) a (3) prepojili, a skontrolujte, či je hladina na nule.

Nechajte kyselinu chlorovodíkovú (3.1) pomaly vytiecť do vzorky, pričom banku nakloňte (4). Vyrovnajte tlaky znížením trubičky (2). Bankou (4) pretrepávajte až do úplného ukončenia uvoľňovania oxidu uhličitého.

Tlak obnovte tak, že kvapalinu v trubičkách (1) a (2) vyrovnáte do rovnakej hladiny. Po niekoľkých minútach, po ustálení objemu plynu zaznamenajte odčítanú hodnotu.

Vykonajte kontrolnú skúšku za tých istých podmienok s 0,5 g uhličitanu vápenatého (3.2).

6.   Výpočet výsledkov

Obsah uhličitanov, vyjadrený ako uhličitan vápenatý, sa vypočíta podľa vzorca:

kde:

X	=	% (w/w) uhličitanov vo vzorke, vyjadrené ako uhličitan vápenatý,
V	=	ml CO2 uvoľneného z navážky vzorky,
V1	=	ml CO2 uvoľneného z 0,5 g CaCO3,
m	=	hmotnosť navážky vzorky v gramoch.

7.   Poznámky

7.1.	Ak je hmotnosť navážky vzorky viac ako 2 g, do banky (4) najskôr pridajte 15 ml destilovanej vody (4) a pred začatím skúšky premiešajte. Pri kontrolnej skúške použite rovnaký objem vody.

7.2.	Ak má použitý prístroj iný objem ako Scheibler-Dietrichov prístroj, musí sa hmotnosť navážky vzorky a kontrolnej látky, ako aj výpočet výsledkov, príslušne upraviť.

P.   STANOVENIE OBSAHU CELKOVÉHO FOSFORU

FOTOMETRICKÁ METÓDA

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah celkového fosforu v krmivách. Je vhodná najmä na analýzu produktov s nízkym obsahom fosforu. V určitých prípadoch (ak ide o produkt bohatý na fosfor) je možné použiť gravimetrickú metódu.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa mineralizuje buď suchým spaľovaním (v prípade organických krmív), alebo rozkladom kyselinou (v prípade minerálnych zlúčenín a tekutých krmív) a umiestni sa do roztoku kyseliny. Roztok sa upraví molybdátovanádovým činidlom. Optická hustota takto vzniknutého žltého roztoku sa meria spektrofotometrom pri 430 nm.

3.   Chemikálie

3.1.	Uhličitan vápenatý.

3.2.	Kyselina chlorovodíková, ρ201,10 g/ml (približne 6 mol/liter).

3.3.	Kyselina dusičná, ρ201,045 g/ml.

3.4.	Kyselina dusičná, ρ201,38 až 1,42 g/ml.

3.5.	Kyselina sírová, ρ201,84 g/ml.

3.6.	Molybdátovanádové činidlo: zmiešajte 200 ml roztoku heptamolybdénanu amónneho (3.6.1), 200 ml roztoku vanadičnanu amónneho (3.6.2) a 134 ml kyseliny dusičnej (3.4) v 1 l odmernej banke. Doplňte destilovanou vodou na celkový objem.

3.6.1.

Roztok heptamolybdénanu amónneho: rozpustite v horúcej vode 100 g heptamolybdénanu amónneho (NH4) 6Mo7O24.4H2O. Pridajte 10 ml amoniaku (hustota 0,91 g/ml) a doplňte vodou na objem 1 liter.

3.6.2.

Roztok vanadičnanu amónneho: rozpustite 2,35 g vanadičnanu amónneho NH4VO3 v 400 ml horúcej vody. Za stáleho miešania pomaly pridajte 20 ml zriedenej kyseliny dusičnej (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O a doplňte vodou na objem 1 liter.

3.7.	Štandardný roztok 1 mg fosforu na 1 ml: vo vode rozpustite 4,387 g dihydrofosforečnanu draselného KH2PO4. Doplňte vodou na objem 1 liter.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Kremenné, porcelánové alebo platinové spaľovacie tégliky.

4.2.	Elektrická muflová pec s termostatom nastavená na 550 oC.

4.3.	250 ml Kjeldahlova banka.

4.4.	Odmerné banky a presné pipety.

4.5.	Spektrofotometer.

4.6.	Skúmavky o priemere približne 16 mm so zátkami o priemere 14,5 mm a s objemom 25 až 30 ml.

5.   Postup

5.1.   Príprava roztoku

Pripravte roztok podľa druhu vzorky, ako je uvedené v bode 5.1.1 alebo 5.1.2.

5.1.1.   Obvyklý postup

Navážte 1 g alebo väčšie množstvo vzorky s presnosťou na 1 mg. Skúšobnú vzorku vložte do Kjeldahlovej banky, pridajte 20 ml kyseliny sírovej (3.5), pretrepte, aby sa látka úplne nasýtila kyselinou a aby sa zamedzilo jej prilepeniu na steny banky, zahrejte a 10 minút udržujte na bode varu. Nechajte pomaly vychladnúť, pridajte 2 ml kyseliny dusičnej (3.4), jemne zahrejte, nechajte pomaly vychladnúť, pridajte trochu viac kyseliny dusičnej (3.4) a priveďte znovu do bodu varu. Tento postup opakujte, až kým nezískate bezfarebný roztok. Ochlaďte, pridajte trochu vody, zlejte kvapalinu do 500 ml odmernej banky, Kjeldahlovu banku vypláchnite horúcou vodou. Nechajte vychladnúť, doplňte vodou do celkového objemu, zhomogenizujte a prefiltrujte.

5.1.2.   Vzorky obsahujúce organické látky a vzorky bez dihydrofosforečnanov vápenatých a horečnatých

Navážte 2,5 g vzorky s presnosťou na 1 mg do spaľovacieho téglika. Miešajte skúšobnú vzorku, až kým sa úplne nespojí s 1 g uhličitanu vápenatého (3.1). Spopolňujte v peci pri teplote 550 oC, až kým nezískate biely alebo sivý popol (malé množstvo dreveného uhlia neprekáža). Preneste popol do 250 ml kadičky. Pridajte 20 ml vody a kyselinu chlorovodíkovú (3.2), až kým neprestane šumieť. Pridajte ďalších 10 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.2). Uložte kadičku do pieskového kúpeľa a odparujte do sucha, čím sa kremeň prevedie na nerozpustnú formu. Rozpustite zvyšok v 10 ml kyseliny dusičnej (3.3) a varte v pieskovom kúpeli alebo na vyhrievacej platni 5 minút bez odparovania do sucha. Zlejte kvapalinu do 500 ml odmernej banky, kadičku niekoľkokrát vypláchnite horúcou vodou. Nechajte vychladnúť, objem doplňte vodou, zhomogenizujte a prefiltrujte.

5.2.   Vyfarbenie a meranie optickej hustoty

Zrieďte alikvotnú časť filtrátu získaného podľa bodu 5.1.1 alebo 5.1.2, aby ste získali koncentráciu fosforu, nie väčšiu ako 40 μg/ml. Do skúmavky (4.6) vlejte 10 ml tohto roztoku a pridajte 10 ml molybdátovanádového činidla (3.6). Zhomogenizujte a nechajte odstáť najmenej 10 minút pri teplote 20 oC. Zmerajte optickú hustotu v spekrofotometri pri 430 nm oproti roztoku získanému pridaním 10 ml molybdátovanádového činidla (3.6) do 10 ml vody.

5.3.   Kalibračná krivka

Zo štandardného roztoku (3.7) pripravte roztoky obsahujúce 5, 10, 20, 30 a 40 μg fosforu na ml. Zoberte 10 ml z každého roztoku a pridajte do nich 10 ml molybdátovanádového činidla (3.6). Zhomogenizujte a nechajte odstáť najmenej 10 minút pri teplote 20 oC. Zmerajte optickú hustotu, ako je uvedené v bode 5.2. Zostrojte kalibračnú krivku vynesením optických hustôt oproti zodpovedajúcim množstvám fosforu. Pri koncentráciách medzi 0 a 40 μg bude krivka lineárna.

6.   Výpočet výsledkov

Použitím kalibračnej krivky stanovte množstvo fosforu v skúšobnej vzorke.

Výsledok vyjadríte ako percentá zo vzorky.

Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

—	3 % relatívnych z hodnoty vyššieho výsledku pri obsahu fosforu nižšom ako 5 %,

—	0,15 % v absolútnej hodnote pri obsahu fosforu 5 % alebo viac.

Q.   STANOVENIE CHLÓRU Z CHLORIDOV

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť množstvo chlóru v chloridoch rozpustných vo vode, bežne vyjadrené ako chlorid sodný. Uplatňuje sa v prípade všetkých krmív.

2.   Podstata metódy

Chloridy sa rozpustia vo vode. Ak produkt obsahuje organické látky, vyčíri sa. Roztok sa mierne okyslí kyselinou dusičnou a chloridy sa vyzrážajú vo forme chloridu strieborného roztokom dusičnanu strieborného. Prebytok dusičnanu strieborného sa stitruje roztokom tiokyanatanu amónneho Volhardovou metódou.

3.   Chemikálie

3.1.	Roztok tiokyanatanu amónneho 0,1 mol/liter.

3.2.	Roztok dusičnanu strieborného 0,1 mol/liter.

3.3.	Nasýtený roztok síranu železito-amónneho (NH4)Fe(SO4)2.

3.4.	Kyselina dusičná, hustota: 1,38 g/ml.

3.5.	Dietyléter.

3.6.

Acetón.

3.7.	Carrezovo činidlo I: rozpustite vo vode 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého Zn(CH3COO)2 2H2O a 3 g ľadovej kyseliny octovej. Doplňte objem vodou na 100 ml.

3.8.	Carrezovo činidlo II: rozpustite vo vode 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného, K4 Fe (CN)6 3H2O. Doplňte objem vodou na 100 ml.

3.9.	Aktívne uhlie, ktoré neobsahuje chloridy a ani ich neabsorbuje.

4.   Prístrojové vybavenie

Mixér (trepačka): približne 35 až 40 ot/min.

5.   Postup

5.1.   Príprava roztoku

Pripravte roztok podľa druhu vzorky, ako je uvedené v bodoch 5.1.1, 5.1.2 alebo 5.1.3.

Zároveň vykonajte slepý pokus bez použitia vzorky, ktorá sa má analyzovať.

5.1.1.   Vzorky bez organických látok

Navážte s presnosťou na 1 mg vzorku v množstve najviac 10 g, aby obsahovala najviac 3 g chlóru vo forme chloridov. Vložte spolu so 400 ml vody do 500 ml odmernej banky pri teplote približne 20 oC. Miešajte po dobu tridsať minút v trepačke, doplňte na požadovaný objem, zhomogenizujte a prefiltrujte.

5.1.2.   Vzorky s obsahom organických látok, okrem produktov uvedených v bode 5.1.3

Navážte približne 5 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte spolu s 1 g aktívneho uhlia do 500 ml odmernej banky. Pridajte 400 ml vody pri teplote približne 20 oC a 5 ml Carrezovho činidla I (3.7), miešajte 30 sekúnd a pridajte 5 ml Carrezovho činidla II (3.8). Miešajte po dobu tridsať minút v trepačke, doplňte na požadovaný objem, zhomogenizujte a prefiltrujte

5.1.3.   Tepelne upravené krmivá, ľanové výlisky a múčka, produkty bohaté na ľanovú múčku a ostatné produkty bohaté na slizovité alebo na koloidné látky (napr. dextrínovaný škrob)

Pripravte roztok postupom opísaným v bode 5.1.2, ale bez filtrácie. Nechajte usadiť (podľa potreby odstreďte), odoberte 100 ml supernatantu a preneste do 200 ml odmernej banky. Zmiešajte s acetónom (3.6) a doplňte na požadovaný objem týmto rozpúšťadlom, zhomogenizujte a prefiltrujte.

5.2.   Titrácia

Do Erlenmeyerovej banky napipetujtev 25 ml až 100 ml filtrátu (podľa predpokladaného obsahu chlóru) získaného podľa bodov 5.1.1, 5.1.2 alebo 5.1.3. Primeraná časť nesmie obsahovať viac ako 150 mg chlóru (Cl). Podľa potreby zrieďte vodou na objem najmenej 50 ml, pridajte 5 ml kyseliny dusičnej (3.4), 20 ml nasýteného roztoku síranu železito-amónneho (3.3) a z byrety naplnenej po nulovú značku 2 kvapky roztoku tiokyanatanu amónneho (3.1). Byretou pridajte roztok dusičnanu strieborného (3.2), tak aby bol v prebytku 5 ml. Pridajte 5 ml dietyléteru (3.5) a intenzívne pretrepte, aby sa vytvorila zrazenina. Prebytok dusičnanu strieborného stitrujte roztokom tiokyanatanu amónneho (3.1) až do vzniku jednu minútu trvajúceho červenkasto-hnedého sfarbenia.

6.   Výpočet výsledkov

Množstvo chlóru (X) vyjadrené ako % chloridu sodného sa vypočíta pomocou tohto vzorca:

kde:

V1	=	ml pridaného roztoku dusičnanu strieborného 0,1 mol/l,
V2	=	ml roztoku tiokyanatanu amónneho 0,1 mol/l použitého na titráciu,
m	=	hmotnosť vzorky.

Ak slepý pokus naznačil, že roztok dusičnanu strieborného 0,1 mol/l sa spotreboval, odpočítajte túto hodnotu od objemu (V1 - V2).

7.   Poznámky

7.1.	Titráciu možno vykonať aj potenciometricky.

7.2.	Produkty veľmi bohaté na oleje a tuky najskôr odtučnite dietyléterom alebo petroléterom.

7.3.	V prípade rybej múčky možno titráciu vykonať Mohrovou metódou.

---

(1)  Pri sušení obilnín, múky, krúpov a šrotu musí mať sušiareň takú tepelnú výkonnosť, aby sa jej teplota nastavená na 131 oC, po vložení najväčšieho počtu skúšobných vzoriek na súčasné sušenie, vrátila na pôvodnú hodnotu do 45 minút. Vetranie sušiarne musí byť také, aby bol rozdiel medzi výsledkami sušenia najväčšieho možného vloženého počtu vzoriek bežnej pšenice počas dvoch hodín a výsledkami získanými po štvorhodinovom sušení menší ako 0,15 %.

(2)  V prípade, že olej musí byť následne podrobený testovaniu, nahraďte fragmenty pemzového kameňa sklenenými guľôčkami.

(3)  Ú. v. ES L 125, 23.5.1996, s. 35.

PRÍLOHA IV

METÓDY ANALÝZY NA KONTROLU OBSAHU POVOLENÝCH DOPLNKOVÝCH LÁTOK V KRMIVÁCH

A.   STANOVENIE VITAMÍNU A

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah vitamínu A (retinolu) v krmivách a premixoch. Vitamín A zahŕňa all-trans-retinyl alkohol a jeho cis-izoméry, ktoré sa stanovia touto metódou. Obsah vitamínu A sa vyjadrí v medzinárodných jednotkách (m.j.) na kg. Jedna m.j. zodpovedá aktivite 0,300 μg all-trans-vitamín A alkoholu alebo 0,344 μg all-trans-vitamín A acetátu alebo 0,550 μg all-trans-vitamín A palmitátu.

Limit kvantifikácie je 2 000 m. j. vitamín A/kg.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa hydrolyzuje etanolovým roztokom hydroxidu draselného a vitamín A sa extrahuje do petroléteru. Rozpúšťadlo sa odstráni odparením a zvyšok sa rozpustí v metanole a v prípade potreby sa zriedi na požadovanú koncentráciu. Obsah vitamínu A sa stanoví na reverznej fáze vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (RP-HPLC) použitím UV detektora alebo fluorescenčného detektora. Chromatografické parametre sa vyberajú tak, aby nedošlo k oddeleniu all-trans-vitamín A alkoholu a jeho cis-izomérov.

3.   Chemikálie

3.1.	Etanol, σ = 96 %

3.2.	Petroléter, rozpätie bodu varu 40 oC – 60 oC

3.3.

Metanol

3.4.	Roztok hydroxidu draselného c = 50 g/100 ml

3.5.	Roztok askorbátu sodného c = 10 g/100 ml (pozri poznámku 7.7)

3.6.	Sulfid sodný, Na2S · x H2O (x = 7 – 9)

3.6.1.

Roztok sulfidu sodného, c = 0,5 mol/l v glycerole, β = 120 g/l (pre x = 9) (pozri poznámku 7.8)

3.7.	Roztok fenolftaleínu, c = 2 g/100 ml v etanole (3.1)

3.8.	2-Propanol

3.9.	Mobilná fáza pre HPLC: zmes metanolu (3,3) a vody, napr. 980 + 20 (v + v). Presný pomer sa stanoví podľa charakteristiky použitej kolóny

3.10.

Dusík bez obsahu kyslíka

3.11.

All-trans-vitamín A acetát, extra čistý, so zaručenou aktivitou, napr. 2,80 × 106 m.j./g

3.11.1.

Zásobný roztok all-trans-vitamín A acetátu: do 100 ml odmernej banky navážte 50 mg acetátu vitamínu A s presnosťou na 0,1 mg (3.11). Rozpusťte v 2-propanole (3.8) a doplňte po značku tým istým rozpúšťadlom. Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 1 400 m.j. vitamínu A na ml. Presný obsah sa musí stanoviť podľa bodu 5.6.3.1.

3.12.

All-trans-vitamín A palmitát, extra čistý, so zaručenou aktivitou, napr. 1,80 × 106 m.j./g

3.12.1.

Zásobný roztok all-trans-vitamín A palmitátu: do 100 ml odmernej banky navážte 80 mg acetátu vitamínu A s presnosťou na 0,1 mg (3.12). Rozpusťte v 2-propanole (3.8) a doplňte po značku tým istým rozpúšťadlom. Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 1 400 m.j. vitamínu A na ml. Presný obsah sa musí stanoviť podľa bodu 5.6.3.2.

3.13.

2,6-di-terc-butyl-4-metylfenol (BHT) (pozri poznámku 7.5)

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Rotačná vákuová odparka

4.2.	Hnedé sklo

4.2.1.

Kužeľová banka alebo banka s rovným dnom, 500 ml, so zábrusovým hrdlom

4.2.2.

Odmerné banky so zábrusovými zátkami, s úzkym hrdlom, 10, 25, 100 a 500 ml

4.2.3.

Oddeľovacie lieviky, kónické, 1 000 ml, so zábrusovými zátkami

4.2.4.

Hruškovité banky, 250 ml, so zábrusovými hrdlami

4.3.	Allihnov chladič, dĺžka plášťa 300 mm, so zábrusovým spojom, s prípojkou na prívod plynu

4.4.	Skladaný filtračný papier na fázovú separáciu, priemer 185 mm (napr. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5.	Prístroj HPLC so vstrekovacím systémom

4.5.1.

Kolóna na kvapalnú chromatografiu, 250 mm × 4 mm, s náplňou C18, 5 alebo 10 μm alebo ekvivalentná (kritérium účinnosti: za uvedených podmienok HPLC len jeden pík pre všetky all-retinolové izoméry)

4.5.2.

UV alebo fluorescenčný detektor s nastaviteľnou vlnovou dĺžkou

4.6.	Spektrofotometer s 10 mm kremennými kyvetami

4.7.	Vodný kúpeľ s magnetickým miešaním

4.8.	Extrakčná aparatúra (pozri obrázok 1) pozostávajúca zo:

4.8.1.

skleneného valca s objemom 1 l, so zábrusovým hrdlom a zátkou;

4.8.2.

sklenenej vložky so zábrusom, s bočným ramenom a s nastaviteľnou trubicou vedenou stredom. Nastaviteľná rúrka musí mať spodný koniec v tvare písmena U a na opačnom konci stričku tak, aby vrchná tekutá vrstva vo valci mohla byť prenesená do oddeľovacieho lievika.

5.   Postup

Poznámka

:

Vitamín A je citlivý na (UV) svetlo a na oxidáciu. Všetky činnosti sa musia vykonávať bez svetla (používať tmavé sklo alebo sklo obalené hliníkovou fóliou) a kyslíka (vytlačí sa dusíkom). Počas extrakcie sa vzduch nad kvapalinou nahradí dusíkom (zabráňte nadbytočnému tlaku občasným uvoľnením zátky).

5.1.   Príprava vzorky

Zomeľte vzorku tak, aby prešla sitom o veľkosti ôk 1 mm, pričom zabráňte, aby sa pri mletí zohriala. Mletie sa musí vykonať tesne pred navážením a zmydelnením, inak môže dôjsť k stratám vitamínu A.

5.2.   Zmydelnenie

V závislosti od obsahu vitamínu A navážte 2 g až 25 g vzorky s presnosťou na 1 mg do 500 ml banky s rovným dnom alebo do kužeľovej banky (4.2.1). Do banky sa postupne pridá za krúženia 130 ml etanolu (3.1), približne 100 mg BHT (3.13), 2 ml roztoku askorbátu sodného (3.5) a 2 ml roztoku sulfidu sodného (3.6). Pripevnite chladič (4.3) k banke a ponorte banku do vodného kúpeľa s magnetickým miešaním (4.7). Zahrejte až do varu a nechajte 5 minút refluxovať. Potom pridajte cez chladič (4.3) 25 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4) a nechajte refluxovať ďalších 25 minút za miešania pod slabým prúdom dusíka. Potom chladič vypláchnite približne 20 ml vody a ochlaďte obsah banky na laboratórnu teplotu.

5.3.   Extrakcia

Po dekantácii a po premytí celkovým objemom 250 ml vody zmydelnený roztok kvantitatívne preneste do 1 000 ml oddeľovacieho lievika (4.2.3) alebo do extrakčnej aparatúry (4.8). Vymyte zmydelňovaciu banku postupne 25 ml etanolu (3.1) a 100 ml petroléteru (3.2) a preneste tieto kvapaliny do oddeľovacieho lievika alebo do extrakčnej aparatúry. Pomer vody a etanolu v zmiešanom roztoku musí byť okolo 2 : 1. Oddeľovacím lievikom intenzívne pretrepávajte 2 minúty a potom nechajte 2 minúty usadiť.

5.3.1.   Extrakcia s použitím oddeľovacieho lievika (4.2.3)

Po oddelení vrstiev (pozri poznámku 7.3) preneste vrstvu petroléteru do ďalšieho oddeľovacieho lievika (4.2.3). Zopakujte túto extrakciu dvakrát so 100 ml petroléteru (3.2) a dvakrát s 50 ml petroléteru (3.2).

Spojené extrakty premyte dvakrát 100 ml vody v oddeľovacom lieviku miernym krúžením (aby sa zabránilo vytvoreniu emulzie) a potom opakovaným pretrepaním ďalšími 100 ml vody, až kým voda nezostane po pridaní roztoku fenolftaleínu (3.7) bezfarebná (premytie štyrikrát zvyčajne postačuje). Premytý extrakt prefiltrujte do 500 ml odmernej banky (4.2.2) cez suchý skladaný filter na fázovú separáciu (4.4), aby sa odstránila všetka suspendovaná voda. Oddeľovací lievik a filter opláchnite 50 ml petroléteru (3.2), banku doplňte po značku petroléterom (3.2) a dobre zamiešajte.

5.3.2.   Extrakcia v extrakčnej aparatúre (4.8)

Po oddelení vrstiev (pozri poznámku 7.3) vymeňte zátku skleneného valca (4.8.1) za sklenenú vložku so zábrusom (4.8.2) a nastavte spodný koniec nastaviteľnej rúrky v tvare písmena U tak, aby bol tesne nad hladinou. Pomocou tlaku dusíka do bočného ramena preneste hornú vrstvu petroléteru do 1 000 ml oddeľovacieho lievika (4.2.3). Do skleneného valca pridajte 100 ml petroléteru (3.2), zazátkujte a dobre premiešajte. Nechajte oddeliť vrstvy a hornú vrstvu preneste opäť do oddeľovacieho lievika. Opakujte extrakciu ďalšími 100 ml petroléteru (3.2), potom dvakrát po 50 ml petroléteru (3.2) a vrstvy petroléteru pridajte do oddeľovacieho lievika.

Spojené extrakty petroléteru premyte postupom opísaným v bode 5.3.1. a ďalej postupujte podľa tohto bodu.

5.4.   Príprava roztoku vzorky pre HPLC

Alikvotnú časť roztoku petroléteru (z 5.3.1. alebo 5.3.2) napipetujte do 250 ml hruškovitej banky (4.2.4). Odparte rozpúšťadlo takmer dosucha v rotačnej vákuovej odparke (4.1) za zníženého tlaku pri teplote kúpeľa nepresahujúcej 40 oC. Obnovte atmosférický tlak vpustením dusíka (3.10) a vyberte banku z rotačnej odparky. Odstráňte zvyšné rozpúšťadlo prúdom dusíka (3.10) a zvyšok ihneď rozpustite v známom objeme (10 – 100 ml) metanolu (3.3) (koncentrácia vitamínu A musí byť v rozsahu od 5 m.j./ml do 30 m.j./ml).

5.5.   Stanovenie HPLC

Vitamín A sa oddelí na reverznej fáze kolóny C18 (4.5.1) a koncentrácia sa zmeria UV detektorom (325 nm) alebo fluorescenčným detektorom (excitácia: 325 nm, emisia: 475 nm) (4.5.2).

Vstreknite alikvotnú časť (napr. 20 μl) roztoku metanolu získaného podľa bodu 5.4 a vymyte mobilnou fázou (3.9). Vypočítajte priemernú výšku (plochu) píku niekoľkých nástrekov roztoku tej istej vzorky a priemernú výšku (plochu) píku niekoľkých nástrekov kalibračných roztokov (5.6.2).

Podmienky HPLC

Odporúčané sú nasledujúce podmienky; iné podmienky sa môžu použiť, ak zabezpečia dosiahnutie ekvivalentných výsledkov.

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu (4.5.1):	250 mm × 4 mm, s náplňou C18, 5 alebo 10 μm, alebo ekvivalentná
Mobilná fáza (3.9):	zmes metanolu (3.3) a vody napr. 980 + 20 (v + v).
Prietoková rýchlosť:	1 – 2 ml/min
Detektor (4.5.2):	UV detektor (325 nm) alebo fluorescenčný detektor (excitácia: 325 nm, emisia: 475 nm)

5.6.   Kalibrácia

5.6.1.   Príprava pracovných štandardných roztokov

Do 500 ml banky s rovným dnom alebo do kužeľovej banky (4.2.1) napipetujte 20 ml zásobného roztoku vitamín A acetátu (3.11.1) alebo 20 ml zásobného roztoku vitamín A palmitátu (3.12.1) a hydrolyzujte podľa bodu 5.2, ale nepridávajte BHT. Následne extrahujte petroléterom (3.2) podľa bodu 5.3 a doplňte petroléterom na 500 ml (3.2). Odparte 100 ml tohto roztoku na rotačnej odparke (pozri bod 5.4) takmer dosucha, odstráňte zvyšné rozpúšťadlo prúdom dusíka (3.10) a zvyšok opäť rozpustite v 10,0 ml metanolu (3.3). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 560 m.j. vitamínu A na ml. Presný obsah sa musí stanoviť podľa bodu 5.6.3.3. Pracovný štandardný roztok sa musí pripravovať čerstvý tesne pred použitím.

2,0 ml tohto pracovného štandardného roztoku napipetujte do 20 ml odmernej banky, doplňte metanolom po značku (3.3) a premiešajte. Nominálna koncentrácia tohto zriedeného pracovného štandardného roztoku je 56 m.j. vitamínu A na ml.

5.6.2.   Príprava kalibračných roztokov a kalibračný graf

Do 20 ml odmerných baniek postupne preneste 1,0, 2,0, 5,0 a 10,0 ml zriedeného pracovného štandardného roztoku, doplňte metanolom po značku (3.3) a zamiešajte. Nominálne koncentrácie týchto roztokov sú 2,8, 5,6, 14,0 a 28,0 m.j. vitamínu A na ml.

Niekoľkokrát vstreknite 20 μl každého kalibračného roztoku a stanovte priemernú výšku (plochu) píku. Z priemerných výšok (plôch) píkov zostrojte kalibračný graf s ohľadom na výsledky UV kontroly (5.6.3.3).

5.6.3.   UV štandardizácia štandardných roztokov

5.6.3.1.   Zásobný roztok vitamín A acetátu

Do 50 ml odmernej banky (4.2.2) napipetujte 2,0 ml zásobného roztoku vitamín A acetátu (3.11.1) a doplňte po značku 2-propanolom (3.8). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 56 m.j. vitamínu A na ml. Do 25 ml odmernej banky napipetujte 3,0 ml tohto zriedeného roztoku vitamín A acetátu a doplňte po značku 2-propanolom (3.8). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 6,72 m.j. vitamínu A na ml. V spektrofotometri (4.6) zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti 2-propanolu (3.8) v rozmedzí 300 nm a 400 nm. Extinkčné maximum musí byť medzi 325 nm a 327 nm.

Výpočet obsahu vitamínu A:

m.j. vitamínu A/ml = E326 × 19,0

( pre vitamín A acetát = 1 530 pri 326 nm v 2-propanole)

5.6.3.2.   Zásobný roztok vitamín A palmitátu

Do 50 ml odmernej banky (4.2.2) napipetujte 2,0 ml zásobného roztoku vitamín A palmitátu (3.12.1) a doplňte po značku 2-propanolom (3.8). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 56 m.j. vitamínu A na ml. Do 25 ml odmernej banky napipetujte 3,0 ml tohto zriedeného roztoku vitamín A palmitátu a doplňte po značku 2-propanolom (3.8). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 6,72 m.j. vitamínu A na ml. V spektrofotometri (4.6) zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti 2-propanolu (3.8) v rozmedzí 300 nm a 400 nm. Extinkčné maximum musí byť medzi 325 nm a 327 nm.

Výpočet obsahu vitamínu A:

m.j. vitamínu A/ml = E326 × 19,0

( pre vitamín A palmitát = 957 pri 326 nm v 2-propanole)

5.6.3.3.   Pracovný štandardný roztok vitamínu A

Do 50 ml odmernej banky (4.2.2) napipetujte 3,0 ml nezriedeného pracovného štandardného roztoku vitamínu A pripraveného podľa bodu 5.6.1 a doplňte po značku 2-propanolom (3.8). Do 25 ml odmernej banky napipetujte 5,0 ml tohto roztoku a doplňte po značku 2-propanolom (3.8). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 6,72 m.j. vitamínu A na ml. V spektrofotometri (4.6) zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti 2-propanolu (3.8) v rozmedzí 300 nm a 400 nm. Extinkčné maximum musí byť medzi 325 nm a 327 nm.

Výpočet obsahu vitamínu A:

m.j. vitamínu A/ml = E325 × 18,3

( pre vitamín A alkohol = 1 821 pri 325 nm v 2-propanole)

6.   Výpočet výsledkov

Z priemernej výšky (plochy) píku vitamínu A v roztoku vzorky stanovte koncentráciu roztoku vzorky v m.j./ml porovnaním s kalibračným grafom (5.6.2).

Obsah w vitamínu A v m.j./kg vzorky sa vypočíta podľa vzorca:

[m.j./kg]

kde:

c	=	koncentrácia vitamínu A v roztoku vzorky (5.4) v m.j./ml,
V1	=	objem roztoku vzorky (5.4) v ml,
V2	=	objem alikvotnej časti z 5.4 v ml,
m	=	hmotnosť navážky vzorky v g.

7.   Poznámky

7.1.	V prípade vzoriek s nízkou koncentráciou vitamínu A je vhodné spojiť extrakty petroléteru z dvoch dávok po zmydelnení (navažované množstvo: 25 g) do jedného roztoku vzorky pre stanovenie HPLC.

7.2.	Navážka vzorky odobratej na analýzu nesmie obsahovať viac ako 2 g tuku.

7.3.	Ak nedôjde k oddeleniu fáz, pridajte približne 10 ml etanolu (3.1) aby sa narušila emulzia.

7.4.	V prípade oleja z treščej pečene a iných čistých tukov sa má čas zmydelnenia predĺžiť na 45 – 60 minút.

7.5.	Namiesto BHT sa môže použiť hydrochinón

7.6.	Použitím kolóny s normálnou fázou je možné oddeliť izoméry retinolu. Avšak v takomto prípade sa výšky (plochy) všetkých píkov cis a trans izomérov musia pri výpočte spočítať.

7.7.	Namiesto roztoku askorbátu sodného sa môže použiť približne 150 mg kyseliny askorbovej.

7.8.	Namiesto roztoku sulfidu sodného sa môže použiť približne 50 mg EDTA.

7.9.

V prípade analýzy vitamínu A v náhradkách mlieka je potrebné venovať špecifickú pozornosť: — pri zmydelňovaní (5.2): v dôsledku množstva tuku prítomného vo vzorke bude pravdepodobne potrebné zvýšiť množstvo roztoku hydroxidu draselného (3.4), — pri extrakcii (5.3): v dôsledku prítomnosti emulzií bude pravdepodobne potrebné zmeniť pomer 2 : 1 medzi vodou a etanolom. Pri kontrole, či uplatnená metóda analýzy vedie k spoľahlivým výsledkom na tejto špecifickej hmote (náhradka mlieka), sa má na ďalšej skúšobnej vzorke vykonať skúška návratnosti. Ak je miera návratnosti nižšia ako 80 %, analytický výsledok sa musí upraviť s ohľadom na návratnosť.

8.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 15 % relatívnych z vyššieho výsledku

9.   Výsledky medzilaboratórneho štúdia  (1)

	Premix	Premixové krmivo	Minerálny koncentrát	Bielkovinové krmivo	Krmivo pre prasiatka
L	13	12	13	12	13
n	48	45	47	46	49
priemer [m.j./kg]	17,02 × 106	1,21 × 106	537 100	151 800	18 070
sr [m.j./kg]	0,51 × 106	0,039 × 106	22 080	12 280	682
r [m.j./kg]	1,43 × 106	0,109 × 106	61 824	34 384	1 910
CVr [ %]	3,0	3,5	4,1	8,1	3,8
sR [m.j./kg]	1,36 × 106	0,069 × 106	46 300	23 060	3 614
R [m.j./kg]	3,81 × 106	0,193 × 106	129 640	64 568	10 119
CVR [ %]	8,0	6,2	8,6	15	20

L	=	počet laboratórií
n	=	počet jednotlivých hodnôt
sr	=	smerodajná odchýlka opakovateľnosti
sR	=	smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti
r	=	opakovateľnosť
R	=	reprodukovateľnosť
CVr	=	variačný koeficient opakovateľnosti
CVR	=	variačný koeficient reprodukovateľnosti

B.   STANOVENIE VITAMÍNU E

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah vitamínu E v krmivách a premixoch. Obsah vitamínu E sa vyjadruje ako mg DL-α-tokoferol acetátu na kg. 1 mg DL-α-tokoferol acetátu zodpovedá 0,91 mg DL-α-tokoferolu (vitamín E).

Limit kvantifikácie je 2 mg vitamínu E/kg. Tento limit je možné dosiahnuť len fluorescenčným detektorom. Pri UV detektore je limit kvantifikácie 10 mg/kg.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa hydrolyzuje etanolovým roztokom hydroxidu draselného a vitamín E sa extrahuje do petroléteru. Rozpúšťadlo sa odstráni odparením a zvyšok sa rozpustí v metanole a v prípade potreby sa zriedi na požadovanú koncentráciu. Obsah vitamínu E sa stanoví na reverznej fáze vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (RP-HPLC) použitím fluorescenčného detektora alebo UV detektora.

3.   Chemikálie

3.1.	Etanol, σ = 96 %

3.2.	Petroléter, rozpätie bodu varu 40 oC – 60 oC

3.3.

Metanol

3.4.	Roztok hydroxidu draselného c = 50 g/100 ml

3.5.	Roztok askorbátu sodného, c = 10 g/100 ml (pozri poznámku 7.7)

3.6.	Sulfid sodný, Na2S · x H2O (x = 7 – 9)

3.6.1.

Roztok sulfidu sodného, c = 0,5 mol/l v glycerole, β = 120 g/l (pre x = 9) (pozri poznámku 7.8)

3.7.	Roztok fenolftaleínu, c = 2 g/100 ml v etanole (3.1)

3.8.	Mobilná fáza pre HPLC: zmes metanolu (3.3) a vody, napr. 980 + 20 (v + v). Presný pomer sa stanoví podľa charakteristiky použitej kolóny.

3.9.	Dusík bez obsahu kyslíka

3.10.

DL-α-tokoferol acetát, extra čistý, so zaručenou aktivitou

3.10.1.

Zásobný roztok DL-α-tokoferol acetátu: do 100 ml odmernej banky navážte 100 mg DL-α-tokopherol acetátu (3.10) s presnosťou na 0,1 mg. Rozpustite v etanole (3.1) a doplňte po značku tým istým rozpúšťadlom. 1 ml tohto roztoku obsahuje 1 mg DL-α-tocoferol acetátu (pozri UV kontrolu v bode 5.6.1.3 a stabilizáciu v poznámke 7.4).

3.11.

DL-α-tokoferol, extra čistý, so zaručenou aktivitou

3.11.1.

Zásobný roztok DL-α-tokoferolu: do 100 ml odmernej banky navážte 100 mg DL-α-tokopherolu (3.11) s presnosťou na 0,1 mg. Rozpustite v etanole (3.1) a doplňte po značku tým istým rozpúšťadlom. 1 ml tohto roztoku obsahuje 1 mg DL-α-tokoferolu (pozri UV kontrolu v bode 5.6.2.3 a stabilizáciu v poznámke 7.4).

3.12.

2,6-di-terc-butyl-4-metylfenol (BHT) (pozri poznámku 7.5)

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Filmová rotačná odparka

4.2.	Hnedé sklo

4.2.1.

Banky s rovným dnom alebo kužeľové banky, 500 ml, so zábrusovým hrdlom

4.2.2.

Odmerné banky so zábrusovými zátkami, s úzkym hrdlom, 10, 25, 100 a 500 ml

4.2.3.

Oddeľovacie lieviky, kónické, 1 000 ml, so zábrusovými zátkami

4.2.4.

Hruškovité banky, 250 ml, so zábrusovým hrdlom

4.3.	Allihnov chladič, dĺžka plášťa 300 mm, so zábrusovým spojom, s prípojkou na prívod plynu

4.4.	Skladaný filtračný papier na oddelenie fáz, priemer 185 mm (napr. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5.	HPLC zariadenie so vstrekovacím systémom

4.5.1.

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu, 250 mm × 4 mm, s náplňou C18, 5 alebo 10 μm alebo ekvivalentná

4.5.2.

Fluorescenčný alebo UV detektor s nastaviteľnou vlnovou dĺžkou

4.6.	Spektrofotometer s 10 mm kremennými kyvetami

4.7.	Vodný kúpeľ s magnetickým miešaním

4.8.	Extrakčná aparatúra (pozri obrázok 1) pozostávajúca zo:

4.8.1.

skleneného valca s objemom 1 l, so zábrusovým hrdlom a zátkou;

4.8.2.

sklenenej vložky so zábrusom, s bočným ramenom a s nastaviteľnou rúrkou vedenou stredom. Nastaviteľná rúrka musí mať spodný koniec v tvare písmena U a na opačnom konci stričku tak, aby vrchná tekutá vrstva vo valci mohla byť prenesená do oddeľovacieho lievika.

5.   Postup

Poznámka

:

Vitamín E je citlivý na (UV) svetlo a na oxidáciu. Všetky činnosti sa majú vykonávať bez svetla (používať tmavé sklo alebo sklo obalené hliníkovou fóliou) a kyslíka (vytlačí sa dusíkom). Počas extrakcie sa vzduch nad kvapalinou nahradí dusíkom (zabráňte nadbytočnému tlaku občasným uvoľnením zátky).

5.1.   Príprava vzorky

Zomeľte vzorku tak, aby prešla sitom o veľkosti ôk 1 mm, pričom zabráňte, aby sa pri mletí zohriala. Mletie sa musí vykonať tesne pred navážením a zmydelnením, inak môže dôjsť k stratám vitamínu E.

5.2.   Zmydelnenie

V závislosti od obsahu vitamínu E navážte 2 g až 25 g vzorky s presnosťou na 0,01 g do 500 ml banky s rovným dnom alebo do kužeľovej banky (4.2.1). Do banky sa postupne pridá za krúženia 130 ml etanolu (3.1), približne 100 mg BHT (3.12), 2 ml roztoku askorbátu sodného (3.5) a 2 ml roztoku sulfidu sodného (3.6). Pripevnite chladič (4.3) k banke a ponorte banku do vodného kúpeľa s magnetickým miešaním (4.7). Zahrejte až do varu a nechajte 5 minút refluxovať. Potom pridajte cez chladič (4.3) 25 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4) a nechajte refluxovať ďalších 25 minút za miešania pod slabým prúdom dusíka. Potom chladič vypláchnite približne 20 ml vody a ochlaďte obsah banky na laboratórnu teplotu.

5.3.   Extrakcia

Po dekantácii a po premytí celkovým objemom 250 ml vody zmydelnený roztok kvantitatívne preneste do 1 000 ml oddeľovacieho lievika (4.2.3) alebo do extrakčnej aparatúry (4.8). Vymyte zmydelňovaciu banku postupne 25 ml etanolu (3.1) a 100 ml petroléteru (3.2) a preneste tieto kvapaliny do oddeľovacieho lievika alebo do extrakčnej aparatúry. Pomer vody a etanolu v zmiešanom roztoku musí byť okolo 2 : 1. Oddeľovacím lievikom intenzívne pretrepávajte 2 minúty a potom nechajte 2 minúty usadiť.

5.3.1.   Extrakcia s použitím oddeľovacieho lievika (4.2.3)

Po oddelení vrstiev (pozri poznámku 7.3) preneste vrstvu petroléteru do ďalšieho oddeľovacieho lievika (4.2.3). Zopakujte túto extrakciu dvakrát so 100 ml petroléteru (3.2) a dvakrát s 50 ml petroléteru (3.2).

Spojené extrakty premyte dvakrát 100 ml vody v oddeľovacom lieviku miernym krúžením (aby sa zabránilo vytvoreniu emulzie) a potom opakovaným pretrepaním ďalšími 100 ml vody, až kým voda nezostane po pridaní roztoku fenolftaleínu (3.7) bezfarebná (premytie štyrikrát zvyčajne postačuje). Premytý extrakt prefiltrujte do 500 ml odmernej banky (4.2.2) cez suchý skladaný filter na fázovú separáciu (4.4), aby sa odstránila všetka suspendovaná voda. Oddeľovací lievik a filter opláchnite 50 ml petroléteru (3.2), banku doplňte po značku petroléterom (3.2) a dobre zamiešajte.

5.3.2.   Extrakcia v extrakčnej aparatúre (4.8)

Po oddelení vrstiev (pozri poznámku 7.3) vymeňte zátku skleneného valca (4.8.1) za sklenenú vložku so zábrusom (4.8.2) a nastavte spodný koniec nastaviteľnej rúrky v tvare písmena U tak, aby bol tesne nad hladinou. Pomocou tlaku dusíka do bočného ramena preneste hornú vrstvu petroléteru do 1 000 ml oddeľovacieho lievika (4.2.3). Do skleneného valca pridajte 100 ml petroléteru (3.2), zazátkujte a dobre premiešajte. Nechajte oddeliť vrstvy a hornú vrstvu preneste opäť do oddeľovacieho lievika. Opakujte extrakciu ďalšími 100 ml petroléteru (3.2), potom dvakrát po 50 ml petroléteru (3.2) a vrstvy petroléteru pridajte do oddeľovacieho lievika.

Spojené extrakty petroléteru premyte postupom opísaným v bode 5.3.1 a ďalej postupujte podľa tohto bodu.

5.4.   Príprava roztoku vzorky pre HPLC

Alikvotnú časť roztoku petroléteru (z 5.3.1. alebo 5.3.2) napipetujte do 250 ml hruškovitej banky (4.2.4). Odparte rozpúšťadlo takmer dosucha v rotačnej vákuovej odparke (4.1) za zníženého tlaku pri teplote kúpeľa nepresahujúcej 40 oC. Obnovte atmosferický tlak vpustením dusíka (3.9) a vyberte banku z rotačnej odparky. Odstráňte zvyšné rozpúšťadlo prúdom dusíka (3.9) a zvyšok ihneď rozpustite v známom objeme (10 – 100 ml) metanolu (3.3) (koncentrácia vitamínu E musí byť v rozsahu od 5 μg/ml do 30 μg/ml.

5.5.   Stanovenie HPLC

Vitamín E sa oddelí na reverznej fáze kolóny C18 (4.5.1) a koncentrácia sa zmeria fluorescenčným detektorom (excitácia: 295 nm, emisia: 330 nm) alebo UV detektorom (292 nm) (4.5.2).

Vstreknite alikvotnú časť (napr. 20 μl) roztoku metanolu získaného podľa bodu 5.4 a vymyte mobilnou fázou (3.8). Vypočítajte priemernú výšku (plochu) píku niekoľkých nástrekov roztoku tej istej vzorky a priemernú výšku (plochu) píku niekoľkých nástrekov kalibračných roztokov (5.6.2).

Podmienky HPLC

Odporúčané sú nasledovné podmienky; iné podmienky sa môžu použiť, ak zabezpečia dosiahnutie ekvivalentných výsledkov.

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu (4.5.1):	250 mm × 4 mm, s náplňou C18 5 μm alebo ekvivalentná
Mobilná fáza (3.8):	zmes metanolu (3.3) a vody napr. 980 + 20 (v + v).
Prietoková rýchlosť:	1 – 2 ml/min
Detektor (4.5.2):	fluorescenčný detektor (exitácia: 295 nm, emisia: 330 nm) alebo UV detektor (292 nm)

5.6.   Kalibrácia (DL-α-tokoferol acetát alebo DL-α-tokoferol)

5.6.1.   Štandard DL-α-tokoferol acetátu

5.6.1.1.    Príprava pracovného štandardného roztoku

Do 500 ml banky s rovným dnom alebo do kužeľovej banky (4.2.1) napipetujte 25 ml zásobného roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1) a hydrolyzujte podľa bodu 5.2. Následne extrahujte petroléterom (3.2) podľa bodu 5.3 a doplňte petroléterom na 500 ml (3.2). Odparte 25 ml tohto roztoku na rotačnej odparke (pozri bod 5.4) takmer dosucha, odstráňte zvyšné rozpúšťadlo prúdom dusíka (3.9) a zvyšok opäť rozpustite v 25,0 ml metanolu (3.3). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 45,5 μg DL-α-tokoferol acetátu na ml. Pracovný štandardný roztok sa musí pripravovať čerstvý tesne pred použitím.

5.6.1.2.    Príprava kalibračných roztokov a kalibračný graf

Do 20 ml odmerných baniek postupne preneste 1,0, 2,0, 5,0 a 10,0 ml pracovného štandardného roztoku, doplňte metanolom po značku (3.3) a zamiešajte. Nominálne koncentrácie týchto roztokov sú 2,28, 4,55, 9,10 a 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolu.

Niekoľkokrát vstreknite 20 μl každého kalibračného roztoku a stanovte priemernú výšku (plochu) píku. Z priemerných výšok (plôch) píkov zostrojte kalibračný graf.

5.6.1.3.    UV štandardizácia zásobného roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1).

Zrieďte 5,0 ml zásobného roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1) na 25,0 ml etanolom a zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti etanolu (3.1) v spektrofotometri (4.6) v rozmedzí 250 nm a 320 nm

Absorbčné maximum má byť pri 284 nm:

= 43,6 pri 284 nm v etanole

Pri tomto zriedení sa musí dosiahnuť extinkčná hodnota 0,84 až 0,88.

5.6.2.   Štandard DL-α-tokoferol acetátu

5.6.2.1.    Príprava pracovného štandardného roztoku

Do 50 ml odmernej banky napipetujte 2 ml zásobného roztoku DL-α-tokoferolu (3.11.1), rozpustite v metanole (3.3) a doplňte objem metanolom po značku. Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 40 μg DL-α-tokoferolu na ml, čo zodpovedá 44,0 μg DL-α-tokoferol acetátu na ml. Pracovný štandardný roztok sa musí pripravovať čerstvý tesne pred použitím.

5.6.2.2.    Príprava kalibračných roztokov a kalibračný graf

Do 20 ml odmerných baniek preneste postupne 1,0, 2,0, 4,0 a 10,0 ml pracovného štandardného roztoku, doplňte metanolom po značku (3.3) a zamiešajte. Nominálne koncentrácie týchto roztokov sú 2,0, 4,0, 8,0 a 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolu, t. j. 2,20, 4,40, 8,79 a 22,0 μg/ml DL-α-tokoferol acetátu.

Vstreknite 20 μl každého kalibračného roztoku niekoľkokrát a stanovte priemernú výšku (plochu) píku. Z priemerných výšok (plôch) píkov zostrojte kalibračný graf.

5.6.2.3.    UV štandardizácia zásobného roztoku DL-α-tokoferolu (3.11.1).

Zrieďte 2,0 ml zásobného roztoku DL-α-tokoferolu (3.11.1) na 25,0 ml etanolom a zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti etanolu (3.1) v spektrofotometri (4.6) v rozmedzí 250 nm a 320 nm. Absorpčné maximum má byť pri 292 nm:

= 75,8 pri 292 nm v etanole

Pri tomto zriedení sa má dosiahnuť extinkčná hodnota 0,6.

6.   Výpočet výsledkov

Z priemernej výšky (plochy) píku vitamínu E v roztoku vzorky stanovte koncentráciu roztoku vzorky v μg/ml (vypočítanú ako α-tokoferol acetát) porovnaním s kalibračným grafom (5.6.1.2 alebo 5.6.2.2).

Obsah w vitamínu E v mg/kg vzorky je daný týmto vzorcom:

[mg/kg]

kde:

c	=	koncentrácia vitamínu E (ako α-tokoferol acetát) roztoku vzorky (5.4) v μg/ml,
V1	=	objem roztoku vzorky (5.4) v ml,
V2	=	objem odobranej alikvotnej časti (5.4) v ml,
m	=	hmotnosť navážky vzorky v g.

7.   Poznámky

7.1.	V prípade vzoriek s nízkou koncentráciou vitamínu E sa odporúča spojiť extrakty petroléteru z dvoch dávok po zmydelnení (navažované množstvo: 25 g) do jedného roztoku vzorky pre stanovenie HPLC.

7.2.	Navážka vzorky odobratej na analýzu nemá obsahovať viac ako 2 g tuku.

7.3.	Ak nedôjde k oddeleniu fáz, pridajte približne 10 ml etanolu (3.1) aby sa narušila emulzia.

7.4.	Po spektrofotometrickom zmeraní roztoku DL-α-tokoferol acetátu alebo DL-α-tokoferolu podľa bodov 5.6.1.3 alebo 5.6.2.3 pridajte do roztoku (3.10.1 alebo 3.10.2) približne 10 mg BHT (3.12) a roztok nechajte v chladničke (skladovateľnosť maximálne 4 týždne).

7.5.	Namiesto BHT sa môže sa použiť hydrochinón

7.6.	Použitím kolóny s normálnou fázou je možné oddeliť α-, β-, χ a δ-tokoferol.

7.7.	Namiesto roztoku askorbátu sodného sa môže použiť približne 150 mg kyseliny askorbovej.

7.8.	Namiesto roztoku sulfidu sodného sa môže použiť približne 50 mg EDTA.

7.9.

Vitamín E acetát sa hydrolyzuje veľmi rýchlo v alkalickom prostredí, a preto je veľmi citlivý na oxidáciu najmä v prítomnosti mikroprvkov, ako sú železo a meď. Následkom toho v prípade stanovenia vitamínu E v premixoch pri množstvách vyšších ako 5 000 mg/kg by mohlo dôjsť k degradácii vitamínu E. Preto sa na potvrdenie odporúča metóda HPLC, ktorá zahŕňa enzymatický rozklad zlúčenín vitamínu E bez alkalického zmydelňovania.

8.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 15 % relatívnych z vyššieho výsledku

9.   Výsledky medzilaboratórnej štúdie  (2)

	Premix	Premixové krmivo	Minerálny koncentrát	Bielkovinové krmivo	Krmivo pre prasiatka
L	12	12	12	12	12
n	48	48	48	48	48
priemer [mg/kg]	17 380	1 187	926	315	61,3
sr [mg/kg]	384	45,3	25,2	13,0	2,3
r [mg/kg]	1 075	126,8	70,6	36,4	6,4
CVr [ %]	2,2	3,8	2,7	4,1	3,8
sR [mg/kg]	830	65,0	55,5	18,9	7,8
R [mg/kg]	2 324	182,0	155,4	52,9	21,8
CVR [ %]	4,8	5,5	6,0	6,0	12,7

L	=	počet laboratórií
n	=	počet jednotlivých hodnôt
sr	=	smerodajná odchýlka opakovateľnosti
sR	=	smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti
r	=	opakovateľnosť
R	=	reprodukovateľnosť
CVr	=	variačný koeficient opakovateľnosti
CVR	=	variačný koeficient reprodukovateľnosti

C.   STANOVENIE MIKROPRVKOV ŽELEZA, MEDI, MANGÁNU A ZINKU

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah mikroprvkov železa, medi, mangánu a zinku v krmivách. Kvantifikačné limity sú tieto:

—	železo (Fe): 20 mg/kg

—	meď (Cu): 10 mg/kg

—	mangán (Mn): 20 mg/kg

—	zinok (Zn): 20 mg/kg

2.   Podstata metódy

Vzorka sa po spálení organických látok, ak nejaké obsahuje, ponorí do roztoku kyseliny chlorovodíkovej. Obsah prvkov železa, medi, mangánu a zinku sa stanoví po vhodnom zriedení metódou atómovej absorpčnej spektrometrie.

3.   Chemikálie

Úvodné poznámky

Na prípravu chemikálií a analytických roztokov používajte vodu, ktorá bola získaná dvojitou destiláciou vody v destilačnom prístroji z borokremičitého skla alebo kremeňa, príp. dvojitou úpravou na iónomeničovej živici, a ktorá neobsahuje katióny prvkov, ktorých obsah sa má stanoviť.

Chemikálie musia mať aspoň analytickú triedu čistoty. Neprítomnosť prvku, ktorého obsah sa má stanoviť, sa musí overiť slepým pokusom. V prípade potreby sa chemikálie musia ďalej vyčistiť

Namiesto štandardných roztokov opísaných nižšie je možné použiť komerčné štandardné roztoky za predpokladu, že sú certifikované a boli pred použitím skontrolované.

3.1.	Kyselina chlorovodíková (d:1,19 g/ml).

3.2.	Kyselina chlorovodíková (6 mol/liter).

3.3.	Kyselina chlorovodíková (0,5 mol/liter).

3.4.	Kyselina fluorovodíková 38 až 40 % (v/v) s obsahom železa (Fe) nižším ako 1 mg/liter a zvyšku po odparení menej ako 10 mg (vo forme síranu)/liter.

3.5.	Kyselina sírová (d: 1,84 g/ml).

3.6.	Peroxid vodíka [približne 100 objemových jednotiek kyslíka (30 % podľa hmotnosti)].

3.7.	Štandardný roztok železa (1 000 μg Fe/ml) pripravený podľa nasledujúceho postupu, príp. ekvivalentný komerčne dostupný roztok: rozpustite 1 g železného drôtu v 200 ml 6 mol/liter kyseliny chlorovodíkovej (3.2), pridajte 16 ml peroxidu vodíka (3.6) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.7.1.

Pracovný štandardný roztok železa (100 μg Fe/ml) pripravený zriedením štandardného roztoku (3.7) vodou v pomere 1 diel roztoku k 9 dielom vody.

3.8.	Štandardný roztok medi (1 000 μg Cu/ml) pripravený podľa nasledujúceho postupu, príp. ekvivalentný komerčne dostupný roztok: — rozpustite 1 g medi vo forme prášku v 25 ml 6 mol/liter kyseliny chlorovodíkovej (3.2), pridajte 5 ml peroxidu vodíka (3.6) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.8.1.

Pracovný štandardný roztok medi (100 μg Cu/ml) pripravený zriedením štandardného roztoku (3.8) vodou v pomere 1 diel roztoku k 9 dielom vody a následne zriedením výsledného roztoku vodou v pomere 1 diel výsledného roztoku k 9 dielom vody.

3.9.	Štandardný roztok mangánu (1 000 μg Mn/ml) pripravený podľa nasledujúceho postupu, príp. ekvivalentný komerčne dostupný roztok: — rozpustite 1 g mangánu vo forme prášku v 25 ml 6 mol/liter kyseliny chlorovodíkovej (3.2) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.9.1.

Pracovný štandardný roztok mangánu (10 μg Mn/ml) pripravený zriedením štandardného roztoku (3.9) vodou v pomere 1 diel roztoku k 9 dielom vody a následne zriedením výsledného roztoku vodou v pomere 1 diel výsledného roztoku k 9 dielom vody.

3.10.

Štandardný roztok zinku (1 000 μg Zn/ml) pripravený podľa nasledujúceho postupu, príp. ekvivalentný komerčne dostupný roztok: — rozpustite 1 g zinku vo forme pásu alebo fólie v 25 ml 6 mol/liter kyseliny chlorovodíkovej (3.2) a objem doplňte vodou na 1 liter.

3.10.1.

Pracovný štandardný roztok zinku (10 μg Zn/ml) pripravený zriedením štandardného roztoku (3.10) vodou v pomere 1 diel roztoku k 9 dielom vody a následne zriedením výsledného roztoku vodou v pomere 1 diel výsledného roztoku k 9 dielom vody.

3.11.

Roztok chloridu lantanitého: rozpustite 12 g oxidu lantanitého v 150 ml vody, pridajte 100 ml 6 mol/liter kyseliny chlorovodíkovej (3.2) a objem doplňte vodou na 1 liter.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Muflová pec s reguláciou teploty a prednostne so zapisovačom.

4.2.	Sklené predmety musia byť tvrdého borokremičitého typu a odporúča sa používať prístrojové vybavenie vyhradené výlučne na stanovenie mikroprvkov.

4.3.	Atómový absorpčný spektrometer spĺňajúci požiadavky metódy, pokiaľ ide o citlivosť a presnosť v požadovanom rozsahu.

5.   Postup  (3)

5.1.   Vzorky s obsahom organických látok

5.1.1.   Spopolnenie a príprava roztoku na analýzu  (4)

5.1.1.1.

Vložte 5 až 10 g vzorky odváženej s presnosťou na 0,2 mg do kremenného alebo platinového téglika (pozri poznámku b), vysušte v sušiarni pri 105 oC a vložte téglik do studenej muflovej pece (4.1). Zatvorte pec [pozri poznámku c)] a v priebehu asi 90 minút postupne zvyšujte teplotu na 450 až 475 oC. Túto teplotu udržujte 4 až 16 hodín (napr. cez noc), aby sa odstránil uhlíkatý materiál, a potom pec otvorte a nechajte vychladnúť [pozri poznámku d)]. Popol zvhlčite vodou a preneste do kadičky o objeme 250 ml. Vymyte téglik približne 5 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1) a pomaly a opatrne pridávajte kyselinu do kadičky (v dôsledku tvorby CO2 môže vzniknúť prudká reakcia). Pridávajte kyselinu chlorovodíkovú (3.1) po kvapkách za miešania, kým roztok celkom neprestane šumieť. Odparujte dosucha za občasného premiešania sklenenou tyčinkou. Následne pridajte 15 ml 6 mol/liter kyseliny chlorovodíkovej (3.2) k zvyšku a potom asi 120 ml vody. Premiešajte sklenenou tyčinkou, ktorá musí ostať v kadičke a kadičku zakryte hodinovým sklíčkom. Pomaly uveďte do varu a udržiavajte na bode varu dovtedy, kým neuvidíte, že sa už žiadny ďalší popol nerozpúšťa. Prefiltrujte na bezpopolovom filtračnom papieri a filtrát zachyťte v 250 ml odmernej banke. Kadičku a filter premyte 5 ml horúcej 6 mol/liter kyseliny chlorovodíkovej (3.2) a dvakrát vriacou vodou. Naplňte odmernú banku po značku vodou (koncentrácia HCl približne 0,5 mol/liter).

5.1.1.2.

Ak je zvyšok na filtračnom papieri čierny (uhlík), vráťte ho späť do pece a znovu ho spopolnite pri teplote 450 až 475 oC. Toto spopolnenie, ktoré trvá iba niekoľko hodín (asi tri až päť), sa skončí, keď je popol biely alebo takmer biely. Rozpustite zvyšok asi v 2 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1), odparte dosucha a pridajte 5 ml 6 mol/liter kyseliny chlorovodíkovej (3.2). Roztok ohrejte, prefiltrujte ho do odmernej banky a dolejte vodu až po značku (koncentrácia HCl približne 0,5 mol/liter). Poznámky: a) Pri stanovovaní obsahu mikroprvkov je dôležité pripraviť sa na riziká kontaminácie, najmä zinkom, meďou a železom. Z tohto dôvodu sa tieto kovy nesmú nachádzať na vybavení používanom pri príprave vzoriek. Kvôli zníženiu všeobecného rizika kontaminácie pracujte v bezprašnej atmosfére s úzkostlivo čistým vybavením a starostlivo poumývanými sklenými pomôckami. Stanovenie obsahu zinku je obzvlášť citlivé na mnoho typov kontaminácie, napr. zo sklených predmetov, chemikáliami, prachom atď. b) Hmotnosť vzorky, ktorá sa má spopolniť, sa vypočíta z približného obsahu mikroprvku v krmive vzhľadom na citlivosť použitého spektrofotometra. Pri určitých krmivách s nízkym obsahom mikroprvkov môže byť potrebné začať s 10 až 20 g vzorkou a doplniť objem konečného roztoku len na 100 ml. c) Spopolnenie sa musí vykonať v uzavretej peci bez prívodu vzduchu alebo kyslíka. d) Teplota, ktorú udáva pyrometer, nesmie prekročiť 475 oC.

5.1.2.   Spektrofotometrické stanovenie

5.1.2.1.    Príprava kalibračných roztokov

Pre každý z prvkov, ktorého obsah sa má stanoviť, pripravte z pracovných štandardných roztokov uvedených v bodoch 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 a 3.10.1 niekoľko kalibračných roztokov, pričom koncentrácia HCl v každom kalibračnom roztoku bude asi 0,5 mol/liter a (v prípade železa, mangánu a zinku) koncentrácia chloridu lantanitého bude ekvivalentná 0,1 % La (w/v).

Vybrané koncentrácie mikroprvkov sa musia nachádzať v rozsahu citlivosti použitého spektrofotometra. V ďalej uvedených tabuľkách je formou príkladov opísané zloženie typických rozsahov kalibračných roztokov; v závislosti od typu a citlivosti použitého spektrofotometra však môže byť potrebné zvoliť iné koncentrácie.

Železo

μg Fe/ml	0	0,5	1	2	3	4	5
ml pracovného štandardného roztoku (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe)	0	0,5	1	2	3	4	5
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml roztoku chloridu lantanitého (3.11) a objem doplňte vodou na 100 ml

Meď

μg Cu/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml pracovného štandardného roztoku (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	8	8	8	8	8	8	8

Mangán

μg Mn/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml pracovného štandardného roztoku (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml roztoku chloridu lantanitého (3.11) a objem doplňte vodou na 100 ml

Zinok

μg Zn/ml	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8
ml pracovného štandardného roztoku (3.9.1) (1 ml = 10 μg Zn)	0	0,5	1	2	4	6	8
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml roztoku chloridu lantanitého (3.11) a objem doplňte vodou na 100 ml

5.1.2.2.    Príprava roztoku na analýzu

Na stanovenie medi je za bežných okolností možné priamo použiť roztok pripravený postupom podľa bodu 5.1.1. V prípade, že bude potrebné dosiahnuť jeho koncentráciu tak, aby bola v medziach kalibračných roztokov, môže sa alikvotná časť preniesť pomocou pipety do 100 ml odmernej banky a objem doplniť 0,5 mol/l kyselinou chlorovodíkovou (3.3) po značku.

Na stanovenie obsahu železa, mangánu a zinku preneste pipetou alikvotnú časť roztoku pripraveného podľa bodu 5.1.1 do 100 ml odmernej banky, pridajte 10 ml roztoku chloridu lantanitého (3.11) a dolejte po značku 0,5 mol/liter kyselinu chlorovodíkovú (3.3) (pozri tiež bod 8 „Poznámky“).

5.1.2.3.    Slepý pokus

Súčasťou slepého pokusu musia byť všetky predpísané kroky postupu s tým, že sa vynecháva materiál vzorky. Ako slepý roztok sa nesmie použiť kalibračný roztok „0“.

5.1.2.4.    Meranie atómovej absorpcie

Odmerajte atómovú absorpciu kalibračných roztokov a analyzovaného roztoku pomocou plameňa acetylén-vzduch pri týchto vlnových dĺžkach:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Každé meranie vykonajte štyrikrát.

5.2.   Minerálne krmivá

Ak vzorka neobsahuje žiadne organické látky, nie je potrebné ju vopred spopolniť. Postupujte podľa bodu 5.1.1.1 a začnite od druhého odseku. Odparovanie roztoku s kyselinou fluorovodíkovou sa môže vynechať.

6.   Výpočet výsledkov

Pomocou kalibračnej krivky vypočítajte koncentráciu mikroprvku v analyzovanom roztoku a výsledok vyjadrite v miligramoch mikroprvku na kilogram vzorky (ppm).

7.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke tým istým analytikom nesmie presiahnuť:

—	5 mg/kg v absolútnej hodnote, pre obsah príslušného mikroprvku do 50 mg/kg,

—	10 % z vyššej hodnoty výsledku pre obsah príslušného mikroprvku od 50 do 100 mg/kg,

—	10 mg/kg v absolútnej hodnote, pre obsah príslušného mikroprvku od 100 do 200 mg/kg,

—	5 % z vyššej hodnoty výsledku pre obsah príslušného mikroprvku nad 200 mg/kg.

8.   Poznámky

Prítomnosť veľkých množstiev fosfátov môže ovplyvniť stanovovanie železa, mangánu a zinku. Takáto interferencia sa musí korigovať pridaním roztoku chloridu lantanitého (3.11). Ak je však vo vzorke pomer hmotnosti Ca + Mg/P > 2, môže sa pridanie roztoku chloridu lantanitého (3.11) do roztoku na analýzu a do kalibračných roztokov vynechať

D.   STANOVENIE HALOFUGINONU

DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-chinazolin-4-(3H)- hydrobromid

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah halofuginonu v krmivách. Kvantifikačný limit je 1 mg/kg.

2.   Podstata metódy

Po úprave horúcou vodou sa halofuginon extrahuje ako voľná zásada do octanu etylnatého a následne sa oddelí vo forme hydrochloridu do vodného roztoku kyseliny. Extrakt sa prečistí iónovo-výmennou chromatografiou. Obsah halofuginonu sa stanoví vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) na reverznej fáze pomocou UV detektora.

3.   Chemikálie

3.1.	Acetonitril, čistoty HPLC

3.2.	Živica amberlitu XAD – 2

3.3.	Octan amónny

3.4.	Octan etylnatý

3.5.	Kyselina octová, ľadová

3.6.	Štandard halofuginonu (DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]- chinazolin-4-(3H)- hydrobromid, E 764)

3.6.1.

Štandardný zásobný roztok halofuginonu, 100 μg/ml Navážte 50 mg halofuginonu (3.6) s presnosťou na 0,1 mg do 500 ml odmernej banky, rozpustite v tlmivom roztoku octanu amónneho (3.18), doplňte po značku tlmivým roztokom a premiešajte. Tento roztok je stály počas troch týždňov pri teplote 5 oC, ak je uložený v tme.

3.6.2.

Kalibračné roztoky Do série 100 ml odmerných baniek preneste 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 a 6,0 ml štandardného zásobného roztoku (3.6.1). Doplňte po značku mobilnou fázou (3.21) a zmiešajte. Koncentrácia halofuginonu v týchto roztokoch je 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 a 6,0 μg/ml. Tieto roztoky sa musia pripraviť čerstvo pred použitím.

3.7.	Kyselina chlorovodíková, (ρ20 približne 1,16 g/ml)

3.8.

Metanol

3.9.	Dusičnan strieborný

3.10.

Askorbát sodný

3.11.

Uhličitan sodný

3.12.

Chlorid sodný

3.13.

EDTA (disodná soľ kyseliny etyléndiamíntetraoctovej)

3.14.

Voda, čistoty HPLC

3.15.

Roztok uhličitanu sodného c = 10 g/100 ml.

3.16.

Roztok uhličitanu sodného nasýteného chloridom sodným, c = 5 g/100 ml Rozpustite 50 g uhličitanu sodného (3.11) vo vode, doplňte vodou na 1 liter a pridávajte chlorid sodný (3.12), kým sa roztok nenasýti.

3.17.

Kyselina chlorovodíková, približne 0,1 mol/l. Zrieďte 10 ml HCl (3.7) s vodou na objem 1 litra.

3.18.

Tlmivý roztok octanu amónneho, približne 0,25 mol/l. Rozpustite 19,3 g octanu amónneho (3.3) a 30 ml kyseliny octovej (3.5) vo vode (3.14) a doplňte vodou na 1 l.

3.19.

Príprava živice amberlitu XAD-2 Premývajte vodou vhodné množstvo amberlitu (3.2), kým neodstránite všetky ióny chloridu, čo sa overí skúškou dusičnanom strieborným (3.20), skúšku vykonajte v odstránenej vodnej fáze. Potom premyte živicu 50 ml metanolu (3.8), odstráňte metanol a živicu uchovávajte pod čerstvým metanolom.

3.20.

Roztok dusičnanu strieborného, približne 0,1 mol/l Rozpustite 0,17 g dusičnanu strieborného (3.9) v 10 ml vody.

3.21.

Mobilná fáza HPLC: Zmiešajte 500 ml acetonitrilu (3.1) s 300 ml tlmivého roztoku octanu amónneho (3.18) a s 1 200 ml vody (3.14). Upravte pH na 4,3 pomocou kyseliny octovej (3.5). Prefiltrujte cez 0,22 μm filter (4.8) a roztok odplyňte (napr. ultrazvukom počas 10 minút). Tento roztok je stály počas jedného mesiaca, ak je uložený v tme a v uzatvorenej nádobe.

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Ultrazvukový kúpeľ

4.2.	Filmová rotačná odparka

4.3.	Odstredivka

4.4.	HPLC prístroj s ultrafialovým detektorom s nastaviteľnou vlnovou dĺžkou alebo s detektorom diódového poľa.

4.4.1.

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu, 300 mm × 4 mm, s náplňou C18, 10 μm alebo ekvivalentná

4.5.	Sklenená kolóna (300 mm × 10 mm) vybavená sklenenou filtračnou fritou a uzatváracím kohútom

4.6.	Filtre so sklenými vláknami, priemer 150 mm

4.7.	Membránové filtre, 0,45 μm

4.8.	Membránové filtre, 0,22 μm

5.   Postup

Poznámka

Halofuginon je ako voľná zásada nestály v alkalických roztokoch a v roztokoch obsahujúcich octan etylnatý. V octane etylnatom nesmie zostať dlhšie ako 30 minút.

5.1.   Všeobecné pokyny

5.1.1.

Analyzujte slepú vzorku krmiva, v ktorom nesmie byť prítomný ani halofuginon, ani interferujúce látky.

5.1.2.

Vykonajte test návratnosti pomocou analýzy slepej vzorky krmiva, do ktorej bolo pridané obdobné množstvo halofuginonu, aké sa nachádza vo vzorke. K príprave vzorky o obsahu halofuginonu 3 mg/kg pridajte 300 μl štandardného zásobného roztoku (3.6.1) do 10 g slepej vzorky krmiva, premiešajte a počkajte 10 minút, kým začnete s extrakciou (5.2). Poznámka : Na účely tejto metódy slepá vzorka krmiva musí byť typovo podobná vzorke skúšanej a pri analýze v nej nesmie byť zistená prítomnosť halofuginonu.

5.2.   Extrakcia

Do odstredivkovej skúmavky s objemom 200 ml navážte 10 g pripravenej vzorky s presnosťou na 0,1 g, pridajte 0,5 g askorbátu sodného (3.10), 0,5 g EDTA (3.13) a 20 ml vody a premiešajte. Skúmavku ponorte na 5 minút do vodného kúpeľa (80 oC). Po ochladení na laboratórnu teplotu pridajte 20 ml roztoku uhličitanu sodného (3.15) a premiešajte. Okamžite pridajte 100 ml octanu etylnatého (3.4) a intenzívne pretrepávajte rukou počas 15 sekúnd. Potom umiestnite skúmavku na tri minúty do ultrazvukového kúpeľa (4.1) bez zátky. Odstreďujte počas dvoch minút a prelejte octanovú fázu cez filter so sklenenými vláknami (4.6) do 500 ml oddeľovacieho lievika. Zopakujte extrakciu vzorky s ďalšou 100 ml dávkou octanu etylnatého. Spojené extrakty premývajte počas jednej minúty 50 ml roztoku uhličitanu sodného nasýteného chloridom sodným (3.16) a odstráňte vodnú vrstvu.

Extrahujte organickú vrstvu počas 1 minúty pomocou 50 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.17). Spodnú vrstvu kyseliny zlejte do 250 ml oddeľovacieho lievika. Znovu extrahujte organickú vrstvu počas 1,5 minúty pomocou ďalších 50 ml kyseliny chlorovodíkovej a zmiešajte s prvým extraktom. Spojené kyselinové extrakty premývajte asi počas 10 sekúnd 10 ml octanu etylnatého (3.4) vírivým pohybom.

Kvantitatívne preneste vodnú vrstvu do 250 ml banky s guľatým dnom a odstráňte organickú fázu. Odparte všetok zvyšný octan etylnatý z kyselinového roztoku pomocou filmovej rotačnej odparky (4.2). Teplota vodného kúpeľa nemá presiahnuť 40 oC. Vo vákuu cca 25 mbar sa všetok zvyšný octan etylnatý odstráni do 5 minút pri teplote 38 oC.

5.3.   Prečistenie

5.3.1.   Príprava kolóny s amberlitom

Kolóna XAD-2 sa pripravuje pre každý extrakt vzorky. Vložte 10 g pripraveného amberlitu (3.19) do sklenenej kolóny (4.5) s metanolom (3.8). Pridajte malý kúsok sklenej vaty do hornej časti živicového stĺpca. Vypustite metanol z kolóny a premyte živicu 100 ml vody, pričom vypúšťanie zastavte, keď kvapalina dosiahne vrch živicového stĺpca. Pred použitím nechajte kolónu stáť 10 minút, aby sa dosiahla rovnováha. Nikdy nenechajte kolónu vyschnúť.

5.3.2.   Prečistenie vzorky

Preneste extrakt (5.2) kvantitatívne do hornej časti pripraveného stĺpca amberlitu (5.3.1), spustite vymývanie a eluát vylejte. Rýchlosť vymývania nemá presiahnuť 20 ml/min. Vypláchnite banku s guľatým dnom 20 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.17), ktorou neskôr premyte stĺpec živice. Všetok zvyšný kyselinový roztok odstráňte pomocou prúdu vzduchu. Premývacie kvapaliny vylejte. Pridajte na kolónu 100 ml metanolu (3.8), nechajte vymývať 5 až 10 ml, eluát zachyťte do 250 ml banky s guľatým dnom. Zvyšný metanol nechajte spolupôsobiť so živicou 10 minút, aby sa dosiahla rovnováha, pokračujte vo vymývaní s rýchlosťou nepresahujúcou 20 ml/min., eluát zachyťte do tej istej banky s guľatým dnom. Odparte metanol na filmovej rotačnej odparke (4.2), pričom teplota vodného kúpeľa nesmie presiahnuť 40 oC. Rozpustite zvyšok v mobilnej fáze (3.21) a kvantitatívne preneste do 10 ml odmernej banky. Doplňte po značku mobilnou fázou a premiešajte. Prefiltrujte alikvotnú časť cez membránový filter (4.7). Tento roztok si nechajte na stanovenie pomocou HPLC (5.4).

5.4.   Stanovenie HPLC

5.4.1.   Parametre

Odporúčané sú nasledujúce podmienky, iné podmienky sa môžu použiť, ak zabezpečia dosiahnutie ekvivalentných výsledkov.

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu (4.4.1)

Mobilná fáza HPLC (3.21)

Prietoková rýchlosť: 1,5 až 2 ml/min.

Vlnová dĺžka pri meraní: 243 nm

Vstrekový objem: 40 až 100 μl.

Skontrolujte stabilitu chromatografického systému tak, že niekoľkokrát nastreknete kalibračný roztok (3.6.2) obsahujúci 3,0 μg/ml, kým nedosiahnete konštantné výšky (alebo plochy) píkov a konštantné retenčné časy.

5.4.2.   Kalibračný graf

Nastreknite každý kalibračný roztok (3.6.2) niekoľkokrát a zmerajte výšky (plochy) píkov pre každú koncentráciu. Zostrojte kalibračný graf, pričom použite priemerné výšky alebo plochy píkov kalibračných roztokov ako ordináty (os y) a príslušné koncentrácie v μg/ml ako abscisy (os x).

5.4.3.   Roztok vzorky

Niekoľkokrát nastreknite extrakt vzorky (5.3.2), pričom použite rovnaký objem ako pri kalibračných roztokoch a z nameraných píkov stanovte priemernú výšku (plochu) píku halofuginonu.

6.   Výpočet výsledkov

Z priemernej výšky (plochy) píku halofuginonu v roztoku vzorky stanovte porovnaním s kalibračnou krivkou (5.4.2) koncentráciu halofuginonu vo vzorke v μg/ml.

Obsah w halofuginonu (mg/kg) sa vypočíta podľa vzorca:

kde:

c	=	koncentrácia halofuginonu v roztoku vzorky v μg/ml,
m	=	hmotnosť navážky vzorky v gramoch.

7.   Validácia výsledkov

7.1.   Zhodnosť

Zhodnosť analytu môžeme potvrdiť kochromatografiou alebo použitím detektora diódového poľa, pomocou ktorého porovnáme spektrá extraktu vzorky a kalibračného roztoku (3.6.2) obsahujúceho 6,0 μg/ml.

7.1.1.   Kochromatografia

Do extraktu vzorky sa pridá vhodné množstvo kalibračného roztoku (3.6.2). Množstvo pridaného halofuginonu musí byť podobné odhadovanému množstvu halofuginonu, zistenému v extrakte vzorky.

Vzhľadom na pridané množstvo a riedenie extraktu sa zvýši len výška píku halofuginonu. Šírka píku, v polovici jeho maximálnej výšky, musí byť v rozpätí ± 10 % pôvodnej šírky.

7.1.2.   Detekcia pomocou diódového poľa

Výsledky sa vyhodnotia podľa nasledujúcich kritérií:

a)	vlnové dĺžky maximálnej absorbancie spektra vzorky a spektra štandardu zaznamenané na vrchole píku chromatogramu musia byť rovnaké s toleranciou určenou rozlišovacou schopnosťou detekčného systému. V prípade detekcie detektorom diódového poľa sa obyčajne pohybuje v rozsahu ± 2 nm;

b)

spektrá vzorky a štandardu zaznamenané na vrchole píku chromatogramu nesmú byť odlišné v častiach spektra medzi 225 a 300 nm v rozsahu od 10 % až 100 % relatívnej absorbancie. Toto kritérium je splnené, keď sú prítomné tie isté maximá a ak v žiadnom pozorovanom bode nepresiahne odchýlka medzi dvomi spektrami 15 % absorbancie analytu štandardu;

c)

spektrá vzostupnej časti, vrcholu a zostupnej časti píku vytvorené extraktom vzorky nesmú byť vzájomne odlišné v častiach spektra medzi 225 až 300 nm v rozsahu 10 % až 100 % relatívnej absorbancie. Toto kritérium je splnené, keď sú prítomné tie isté maximá a ak vo všetkých pozorovaných bodoch odchýlka medzi spektrami nepresiahne 15 % absorbancie spektra vrcholu píku.

Ak niektoré z týchto kritérií nebude splnené, potom prítomnosť analytu nebola potvrdená.

7.2.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,5 mg/kg pre obsah halofuginonu do 3 mg/kg.

7.3.   Návratnosť

V prípade slepej vzorky doplnenej o skúmanú látku musí byť atnosť najmenej 80 %.

8.   Výsledky medzilaboratórnej štúdie

Vykonala sa medzilaboratórna štúdia (5), v rámci ktorej osem laboratórií analyzovalo tri vzorky.

Výsledky

	Vzorka A (slepá) pri prijatí	Vzorka B (sypká)		Vzorka C (granulovaná)
		pri prijatí	po dvoch mesiacoch	pri prijatí	po dvoch mesiacoch
priemer [mg/kg]	ND	2,80	2,42	2,89	2,45
SR [mg/kg]	—	0,45	0,43	0,40	0,42
CVR [ %]	—	16	18	14	17
Návr. [ %]		86	74	88	75

ND	=	nezistené
SR	=	smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti
CVR	=	variačný koeficient reprodukovateľnosti ( %)
Návr.	=	návratnosť ( %)

E.   STANOVENIE ROBENIDÍNU

1,3- bis [(4-chlórbenzylidén)amino]-guanidín-hydrochlorid

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah robenidínu v krmivách. Kvantifikačný limit je 5 mg/kg.

2.   Podstata metódy

Vzorka sa extrahuje okysleným metanolom. Extrakt sa vysuší a alikvotná časť sa podrobí čisteniu na kolóne oxidu hlinitého. Robenidín sa vymýva z kolóny metanolom, skoncentruje sa a doplní na vhodný objem mobilnou fázou. Obsah robenidínu sa stanoví na reverznej fáze vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) pomocou UV detektora.

3.   Chemikálie

3.1.

Metanol

3.2.	Okyslený metanol Do 500 ml odmernej banky preneste 4,0 ml kyseliny chlorovodíkovej (ρ20 = 1,18 g/ml), doplňte po značku metanolom (3.1) a premiešajte. Tento roztok sa musí pripraviť čerstvo pred použitím.

3.3.	Acetonitril, čitsoty HPLC

3.4.	Molekulové sito Typ 3A, guľôčky, 8 – 12 mešov (guľôčky o veľkosti 1,6 – 2,5 mm, kryštalický hlinitokremičitan, priemer pórov 0,3 mm)

3.5.	Oxid hlinitý, kyslý, aktivita triedy I pre stĺpcovú chromatografiu Do vhodnej nádoby navážte 100 g oxidu hlinitého a pridajte 2,0 ml vody. Uzatvorte a pretrepávajte po dobu približne 20 minút. Uchovávajte v dobre uzatvorenej nádobe.

3.6.	Roztok dihydrofosforečnanu draselného, c = 0,025 mol/l. V 1 000 ml odmernej banke rozpustite 3,40 g dihydrofosforečnanu draselného vo vode (čistoty HPLC), doplňte po značku vodou a premiešajte.

3.7.	Roztok hydrofosforečnanu disodného, c = 0,025 mol/l V litrovej odmernej banke rozpustite 3,55 g bezvodého (alebo 4,45 g dihydrátu, príp. 8,95 g dodekahydrátu) hydrofosforečnanu disodného vo vode (čistoty HPLC), doplňte po značku vodou a premiešajte.

3.8.

Mobilná fáza HPLC Zmiešajte spolu tieto chemikálie:   650 ml acetonitrilu (3.3),   250 ml vody (čistoty HPLC),   50 ml roztoku dihydrofosforečnanu draselného (3.6),   50 ml roztoku hydrofosforečnanu disodného (3,7), prefiltrujte cez 0,22 μm filter (4,6) a roztok odplyňte (napr. ultrazvukom počas 10 minút).

3.9.	Štandardná látka Čistý robenidín: 1,3- bis [(4-chlórbenzylidén)amino]-guanidín-hydrochlorid.

3.9.1.

Zásobný štandardný roztok robenidínu: 300 μg/ml Navážte 30 mg štandardnej látky robenidínu (3.9) s presnosťou na 0,1 mg. Rozpustite v okyslenom metanole (3.2) v 100 ml odmernej banke, doplňte po značku tým istým rozpúšťadlom a premiešajte. Banku zabaľte do hliníkovej fólie a skladujte na tmavom mieste.

3.9.2.

Pracovný štandardný roztok robenidínu: 12 μg/ml Preneste 10,0 ml zásobného štandardného roztoku (3.9.1) do 250 ml odmernej banky, doplňte mobilnou fázou (3.8) po značku a premiešajte. Banku zabaľte do hliníkovej fólie a skladujte na tmavom mieste.

3.9.3.

Kalibračné roztoky Do série 50 ml odmerných baniek preneste 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 a 25,0 ml pracovného štandardného roztoku (3.9.2). Doplňte po značku mobilnou fázou (3.8) a premiešajte. Tieto roztoky obsahujú 1,2 μg, 2,4 μg, 3,6 μg, 4,8 μg a 6,0 μg robenidínu v 1 ml. Roztoky sa musia pripravovať čerstvo pred použitím.

3.10.

Voda, čistoty HPLC

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Sklenená kolóna Vyrobená z hnedého skla ukončená uzatváracím kohútom, zásobník s obsahom približne 150 ml, vnútorný priemer 10 – 15 mm, dĺžka 250 mm.

4.2.	Mechanická trepačka alebo magnetická miešačka

4.3.	Filmová rotačná odparka

4.4.	Zariadenie na HPLC s UV detektorom s nastaviteľnou vlnovou dĺžkou, alebo s detektorom diódového poľa, pracujúci v rozsahu 250 až 400 nm.

4.4.1.

Kolóna na vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu: 300 mm × 4 mm, s náplňou C18, 10 μm alebo ekvivalentná

4.5.	Filtračný papier so sklenenými vláknami (Whatman GF/A alebo ekvivalentný)

4.6.	Membráové filtre, 0,22 μm

4.7.	Membráové filtre, 0,45 μm

5.   Postup

Poznámka

:

Robenidín je citlivý na svetlo. Pri všetkých operáciách sa majú používať nádoby z hnedého skla.

5.1.   Všeobecné pokyny

5.1.1.

Analyzujte slepú vzorku krmiva, v ktorej nesmie byť prítomný ani robenidín, ani interferujúce látky.

5.1.2.

Vykonajte test návratnosti pomocou analýzy slepej vzorky krmiva (5.1.1), do ktorej bolo pridané obdobné množstvo robenidínu, aké sa nachádza vo vzorke. S cieľom obohatenia na úroveň 60 mg/kg preneste 3,0 ml zásobného štandardného roztoku (3.9.1) do 250 ml kužeľovej banky. Roztok odparte na cca. 0,5 ml v prúde dusíka. Pridajte 15 g slepej vzorky, premiešajte a počkajte 10 minút pred extrakciou (5.2). Poznámka : Na účely tejto metódy musí byť slepá vzorka krmiva typovo podobná vzorke skúšanej a pri analýze v nej nesmie byť zistená prítomnosť robenidínu.

5.2.   Extrakcia

Navážte približne 15 g pripravenej vzorky s presnosťou na 0,01 g. Preneste do 250 ml kužeľovej banky a pridajte 100,0 ml okysleného metanolu (3.2), zazátkujte a pretrepávajte jednu hodinu v trepačke (4.2). Roztok prefiltrujte cez filtračný papier so sklenenými vláknami (4.5) a celý filtrát zachyťte do 150 ml kužeľovej banky. Pridajte 7,5 g molekulového sita (3.4), zazátkujte a pretrepávajte päť minút. Obsah banky okamžite prefiltrujte cez filtračný papier so sklenenými vláknami. Tento roztok si nechajte na prečistenie (5.3).

5.3.   Prečistenie

5.3.1.   Príprava kolóny s oxidom hlinitým

Do spodnej časti sklenej kolóny (4.1) vložte malú zátku zo sklenenej vaty a utlačte pomocou sklenenej tyčinky. Navážte 11,0 g pripraveného oxidu hlinitého (3.5) a preneste na kolónu. Počas tohto postupu treba minimalizovať vplyv atmosférického vzduchu. Jemne poklepte na spodnom konci kolóny, aby sa oxid hlinitý usadil.

5.3.2.   Prečistenie vzorky

Napipetujte 5,0 ml extraktu vzorky pripravenej podľa (5.2) a preneste na kolónu. Hrot pipety sa oprie tesne o stenu kolóny a roztok sa nechá vsiaknuť do oxidu hlinitého. Robenidín vymyte z kolóny použitím 100 ml metanolu (3.1), pri rýchlosti prietoku 2 – 3 ml/minútu, a eluát zachyťte do 250 ml banky s guľatým dnom. Roztok metanolu odparte do sucha pri zníženom tlaku a teplote 40 oC pomocou filmovej rotačnej odparky (4.3). Zvyšok po odparení rozpustite v 3 – 4 ml mobilnej fázy (3.8) a kvantitatívne preneste do 10 ml odmernej banky. Banku vypláchnite niekoľkými 1 až 2 ml dávkami mobilnej fázy a tieto vyplachovacie roztoky preneste do odmernej banky. Doplňte po značku týmto roztokom a zmiešajte. Prefiltrujte alikvotnú časť cez 0,45 μm membránový filter (4.7). Tento roztok si nechajte na stanovenie pomocou HPLC (5.4).

5.4.   Stanovenie HPLC

5.4.1.   Parametre

Odporúčané sú nasledujúce podmienky, iné podmienky sa môžu použiť, ak zabezpečia dosiahnutie ekvivalentných výsledkov:

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu (4.4.1)

Mobilná fáza HPLC (3.8)

Prietoková rýchlosť: 1,5 až 2 ml/min,

Vlnová dĺžka detektora: 317 nm,

Vstrekový objem: 20 až 50 μl.

Skontrolujte stabilitu chromatografického systému tak, že niekoľkokrát nastreknete kalibračný roztok (3.9.3) obsahujúci 3,6 μg/ml, kým nedosiahnete konštantné výšky píkov a konštantné retenčné časy.

5.4.2.   Kalibračný graf

Nastreknite každý kalibračný roztok (3.9.3) niekoľkokrát a zmerajte výšky (plochy) píkov pre každú koncentráciu. Zostrojte kalibračný graf, pričom použite priemerné výšky vrcholov alebo plochy kalibračných roztokov ako ordináty (os y) a príslušné koncentrácie v μg na ml ako abscisy (os x).

5.4.3.   Roztok vzorky

Niekoľkokrát nastreknite extrakt vzorky (5.3.2), pričom použite rovnaký objem ako pri kalibračných roztokoch a z nameraných píkov stanovte priemernú výšku (plochu) píku robenidínu.

6.   Výpočet výsledkov

Z priemernej výšky (plochy) píku robenidínu v roztoku vzorky stanovte koncentráciu roztoku vzorky v μg/ml pomocou kalibračnej krivky (5.4.2).

Obsah w robenidínu (mg/kg) vzorky je daný týmto vzorcom:

kde:

c	=	koncentrácia robenidínu v roztoku vzorky v μg/ml,
m	=	hmotnosť navážky vzorky v gramoch.

7.   Validácia výsledkov

7.1.   Zhodnosť

Zhodnosť analytu môžeme potvrdiť kochromatografiou alebo použitím detektora diódového poľa, pomocou ktorého sa porovnávajú spektrá extraktu vzorky a kalibračného roztoku (3.9.3) obsahujúceho 6 μg/ml robenidínu.

7.1.1.   Kochromatografia

Do extraktu vzorky sa pridá vhodné množstvo kalibračného roztoku (3.9.3). Množstvo pridaného robenidínu musí byť podobné odhadovanému množstvu robenidínu, zistenému v extrakte vzorky.

Vzhľadom na pridané množstvo a riedenie extraktu sa zvýši len výška píku robenidínu. Šírka píku, v polovici jeho maximálnej výšky, musí byť približne v rozsahu ± 10 % pôvodnej šírky.

7.1.2.   Detekcia detektorom diódového poľa

Výsledky sa vyhodnotia podľa týchto kritérií:

a)	vlnové dĺžky maximálnej absorbancie spektra vzorky a spektra štandardu zaznamenané na vrchole píku chromatogramu musia byť rovnaké s toleranciou určenou rozlišovacou schopnosťou detekčného systému. V prípade detekcie detektorom diódového poľa sa obyčajne pohybuje v rozsahu ± 2 nm;

b)

spektrá vzorky a štandardu zaznamenané na vrchole píku chromatogramu nesmú byť odlišné v častiach spektra medzi 250 a 400 nm v rozsahu od 10 % až 100 % relatívnej absorbancie. Toto kritérium je splnené, keď sú prítomné tie isté maximá a ak v žiadnom pozorovanom bode nepresiahne odchýlka medzi dvomi spektrami 15 % absorbancie analytu štandardu;

c)

spektrá vzostupnej časti, vrcholu a zostupnej časti píku vytvorené extraktom vzorky nesmú byť vzájomne odlišné v častiach spektra medzi 250 a 400 nm v rozsahu 10 % až 100 % relatívnej absorbancie. Toto kritérium je splnené, keď sú prítomné tie isté maximá a ak vo všetkých pozorovaných bodoch odchýlka medzi spektrami nepresiahne 15 % absorbancie spektra vrcholu píku.

Ak niektoré z týchto kritérií nebude splnené, potom prítomnosť analytu nebola potvrdená.

7.2.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 10 % relatívnych z vyššej hodnoty pre obsah robenidínu, ktorý je vyšší ako 15 mg/kg.

7.3.   Návratnosť

V prípade slepej vzorky doplnenej robenidínom musí byť návratnosť najmenej 85 %.

8.   Výsledky medzilaboratórnej štúdie

Zorganizovala sa medzilaboratórna štúdia ES, v rámci ktorej dvanásť laboratórií analyzovalo štyri vzorky krmiva pre hydinu a králiky, sypké alebo granulované. Každá vzorka sa analyzovala dvakrát. Výsledky sú uvedené v tejto tabuľke:

	Hydina		Králiky
	sypké	granulované	sypké	granulované
priemer [mg/kg]	27,00	27,99	43,6	40,1
sr [mg/kg]	1,46	1,26	1,44	1,66
CVr [ %]	5,4	4,5	3,3	4,1
SR [mg/kg]	4,36	3,36	4,61	3,91
CVR [ %]	16,1	12,0	10,6	9,7
Návratnosť [ %]	90,0	93,3	87,2	80,2

sr	=	smerodajná odchýlka opakovateľnosti
CVr	=	variačný koeficient opakovateľnosti, %
SR	=	smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti
CVR	=	variačný koeficient reprodukovateľnosti, %

F.   STANOVENIE DIKLAZURILU

(+)-4-chlorofenyl[2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)fenyl]acetonitril.

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah diklazurilu v krmivách a v premixoch. Detekčný limit je 0,1 mg/kg, limit kvantifikácie je 0,5 mg/kg.

2.   Podstata metódy

Po pridaní vnútorného štandardu sa vzorka extrahuje okysleným metanolom. Pri analýze krmív sa alikvotná časť extraktu prečistí na extrakčnej náplni s tuhou fázou C18. Diklazuril sa vymyje z náplne zmesou okysleného metanolu a vody. Po odparení sa zvyšok rozpustí v zmesi DMF a vody. V prípade premixov sa extrakt odparí a zvyšok rozpustí v zmesi DMF a vody. Obsah diklazurilu sa stanoví ternárnym gradientom na reverznej fáze vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) použitím UV detektora.

3.   Chemikálie

3.1.	Voda, čistoty HPLC

3.2.	Octan amónny

3.3.	Tetrabutylamóniumhydrogénsulfát (TBHS)

3.4.	Acetonitril, čistoty HPLC

3.5.	Metanol, čistoty HPLC

3.6.	N, N-dimetylformamid (DMF)

3.7.	Kyselina chlorovodíková, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8.	Štandardná látka: diklazuril II-24: (+)-4-chlorofenyl[2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)fenyl]acetonitril so zaručenou čistotou, E771.

3.8.1.

Zásobný štandardný roztok diklazurilu, 500 μg/ml. Navážte 25 mg štandardnej látky diklazurilu (3.8) s presnosťou na 0,1 mg do 50 ml odmernej banky. Rozpustite v DMF (3.6), doplňte DMF po značku a premiešajte. Obaľte banku hliníkovou fóliou alebo použite banku z hnedého skla a uložte do chladničky. Pri teplote ≤ 4 oC je roztok stály 1 mesiac.

3.8.2.

Štandardný roztok diklazurilu, 50 μg/ml. Preneste 5,00 ml zásobného štandardného roztoku (3.8.1) do 50 ml odmernej banky, doplňte DMF (3.6) po značku a premiešajte. Obaľte banku hliníkovou fóliou alebo použite banku z hnedého skla a uložte do chladničky. Pri teplote ≤ 4 oC je roztok stály 1 mesiac.

3.9.	Vnútorný štandard: 2,6 dichloro-α-(4-chlorofenyl)-4-(4,5 dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2 (3H) – yl) α-metylbenzén-acetonitril

3.9.1.

Zásobný roztok vnútorného štandardu, 500 μg/ml. Navážte 25 mg vnútorného štandardu (3.9) s presnosťou na 0,1 mg do 50 ml odmernej banky. Rozpustite v DMF (3.6), doplňte DMF po značku a premiešajte. Obaľte banku hliníkovou fóliou alebo použite banku z hnedého skla a uložte do chladničky. Pri teplote ≤ 4 oC je roztok stály 1 mesiac.

3.9.2.

Roztok vnútorného štandardu, 50 μg/ml. Preneste 5,00 ml zásobného roztoku vnútorného štandardu (3.9.1) do 50 ml odmernej banky, doplňte DMF (3.6) po značku a premiešajte. Obaľte banku hliníkovou fóliou alebo použite banku z hnedého skla a uložte do chladničky. Pri teplote ≤ 4 oC je roztok stály 1 mesiac.

3.9.3.

Roztok vnútorného štandardu na premixy, p/1 000 mg/ml (p = nominálny obsah diklazurilu v premixe v mg/kg) Navážte p/10 mg vnútorného štandardu s presnosťou na 0,1 mg do 100 ml odmernej banky, rozpusťte v DMF (3.6) v ultrazvukovom kúpeli (4.6), doplňte DMF po značku a zamiešajte. Obaľte banku hliníkovou fóliou alebo použite banku z hnedého skla a uložte do chladničky. Pri teplote ≤ 4 oC je roztok stály 1 mesiac.

3.10.

Kalibračný roztok, 2 μg/ml. Napipetujte 2,00 ml štandardného roztoku diklazurilu (3.8.2) a 2,00 ml roztoku vnútorného štandardu (3.9.2) do 50 ml odmernej banky. Pridajte 16 ml DMF (3.6), doplňte DMF po značku a premiešajte. Tento roztok sa musí pripraviť čerstvo pred použitím.

3.11.

Extrakčná náplň C18 s tuhou fázou, napr. Bond Elute, veľkosť: 1 cc, hmotnosť sorbentu: 100 mg.

3.12.

Extrakčný roztok: okyslený metanol. Do 1 000 ml metanolu (3.5) napipetujte 5,0 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.7) a premiešajte.

3.13.

Mobilná fáza pre HPLC

3.13.1.

Eluent A: octan amónny – tetrabutylamóniumhydrogénsulfátu, roztok. V 1 000 ml vody (3.1) rozpusťte 5 g octanu amónneho (3.2) a 3,4 g TBHS (3.3) a premiešajte.

3.13.2.

Eluent B: acetonitril (3.4).

3.13.3.

Eluent C: metanol (3.5).

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Mechanická trepačka

4.2.	HPLC prístroj na ternárny gradient

4.2.1.

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu, s náplňou Hypersil ODS 3 μm, 100 mm × 4,6 mm, alebo ekvivalentná

4.2.2.

UV detektor s nastaviteľnou vlnovou dĺžkou alebo detektor diódového poľa

4.3.	Filmová rotačná odparka

4.4.	Membránový filter, 0,45 μm

4.5.	Vákuové odparovacie zariadenie

4.6.	Ultrazvukový kúpeľ

5.   Postup

5.1.   Všeobecné pokyny

5.1.1.   Slepá vzorka

Analyzujte slepú vzorku krmiva, aby ste overili, či neobsahuje ani diklazuril, ani interferujúce látky. Zloženie slepej vzorky má zodpovedať skúmanej vzorke a pri analýze sa nesmie dokázať prítomnosť diklazurilu alebo interferujúcej látky.

5.1.2.   Test návratnosti

Vykonajte test návratnosti pomocou analýzy slepej vzorky krmiva, do ktorej bolo pridané obdobné množstvo diklazurilu, aké sa nachádza vo vzorke. S cieľom obohatiť na úroveň 1 mg/kg pridajte 0,1 ml zásobného štandardného roztoku (3.8.1) do 50 g slepej vzorky, dôkladne premiešajte, nechajte stáť 10 min. pred ďalším postupom (5.2) a ešte niekoľkokrát zamiešajte.

Ak nie je dostupná slepá vzorka zodpovedajúca zložením skúmanej vzorke (pozri bod 5.1.1), test návratnosti sa môže vykonať metódou prídavku štandardu. V tomto prípade sa vzorka, ktorá má byť analyzovaná, obohatí množstvom diklazurilu, ktoré je podobné množstvu už prítomnému vo vzorke. Táto vzorka sa analyzuje spolu s neobohatenou vzorkou a návratnosť sa vypočíta odčítaním.

5.2.   Extrakcia

5.2.1.   Krmivá

Navážte približne 50 g vzorky s presnosťou na 0,01 g. Preneste do 500 ml kužeľovej banky, pridajte 1,00 ml roztoku vnútorného štandardu (3.9.2), 200 ml extrakčného činidla (3.12) a banku zazátkujte. Zmes nechajte cez noc v trepačke (4.1) pretrepať. Nechajte 10 minút usadiť. Preneste 20 ml alikvotnej časti supernatantu do vhodnej sklenenej nádoby a zrieďte 20 ml vody. Preneste tento roztok na extrakčnú náplň (3.11) a nechajte pretiecť pomocou vákua (4.5). Premyte náplň 25 ml zmesi extrakčného činidla (3.12) a vody v pomere 65 + 35 (V + V). Vylejte zozbierané frakcie a vymyte zlúčeniny pomocou 25 ml zmesi extrakčného činidla (3.12) a vody v pomere 80 + 20 (V + V). Odparte túto frakciu dosucha na rotačnej odparke (4.3) pri teplote 60 oC. Zvyšok rozpustite v 1,0 ml DMF (3.6), pridajte 1,5 ml vody (3.1) a zamiešajte. Prefiltrujte cez membránový filter (4.4). Prejdite k ďalšiemu kroku, ktorým je stanovenie HPLC (5.3).

5.2.2.   Premixy

Navážte približne 1 g vzorky s presnosťou na 0,001 g. Preneste do 500 ml kužeľovej banky, pridajte 1,00 ml roztoku vnútorného štandardu (3.9.3), 200 ml extrakčného činidla (3.12) a banku zazátkujte. Zmes nechajte cez noc pretrepať v trepačke (4.1). Nechajte 10 minút usadiť. Preneste alikvotnú časť 10 000/p ml (p = nominálny obsah diklazurilu v premixe v mg/kg) supernatantu do primerane veľkej banky s guľatým dnom. Odparte na vákuovej rotačnej odparke (4.3) dosucha pri 60 oC a zníženom tlaku. Znovu rozpustite zvyšok v 10,0 ml DMF (3.6), pridajte 15,0 ml vody (3.1) a premiešajte. Prejdite k ďalšiemu kroku, ktorým je stanovenie pomocou HPLC (5.3).

5.3.   Stanovenie HPLC

5.3.1.   Parametre

Odporúčané sú nasledujúce podmienky, iné podmienky sa môžu použiť, ak zabezpečia dosiahnutie ekvivalentných výsledkov:

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu (4.2.1):	100 mm × 4,6 mm, s náplňou Hypersil ODS 3 μm alebo ekvivalentná
Mobilná fáza:	Eluent A (3.13.1):	Vodný roztok octanu amónneho a tetrabutyl-amónium hydrogénsulfátu
	Eluent B (3.13.2):	acetonitril
	Eluent C (3.13.3):	metanol
Elučný model:	— lineárny gradient — počiatočné podmienky A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V) — po 10 min gradientová elúcia počas 30 min na: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V). Vypláchnutie s B počas 10 min.
Prietoková rýchlosť:	1,5 – 2 ml/min.
Vstrekový objem:	20 μl
Detekčná vlnová dĺžka:	280 nm

Niekoľkonásobným nastreknutím kalibračného roztoku (3.10) obsahujúceho 2 μl/ml diklazurilu sa skontroluje stabilita chromatografického systému, až kým sa dosiahne konštantná výška píku a konštantné retenčné časy.

5.3.2.   Kalibračný roztok

Niekoľkokrát sa nastrekne 20 μl kalibračného roztoku (3.10) a stanoví sa priemerná výška (plocha) píku diklazurilu a vnútorného štandardu.

5.3.3.   Roztok vzorky

Niekoľkokrát sa nastrekne 20 μl roztoku vzorky (5.2.1 alebo 5.2.2) a stanoví sa priemerná výška (plocha) píku diklazurilu a vnútorného štandardu.

6.   Výpočet výsledkov

6.1.   Krmivá

Obsah w diklazurilu (mg/kg) vzorky je daný týmto vzorcom:

[mg/kg]

kde:

hd,s	=	výška (plocha) píku diklazurilu v roztoku vzorky (5.2.1),
hi,s	=	výška (plocha) píku vnútorného štandardu v roztoku vzorky (5.2.1),
hd,c	=	výška (plocha) píku diklazurilu v kalibračnom roztoku (3.10),
hi,c	=	výška (plocha) píku vnútorného štandardu v kalibračnom roztoku (3.10),
cd,c	=	koncentrácia diklazurilu v kalibračnom roztoku v μg/ml (3.10),
m	=	hmotnosť navážky vzorky v g,
V	=	objem extraktu vzorky podľa 5.2.1 (t. j. 2,5 ml).

6.2.   Premixy

Obsah w diklazurilu (mg/kg) vzorky je daný týmto vzorcom:

[mg/kg]

kde:

hd,c	=	výška (plocha) píku diklazurilu v kalibračnom roztoku (3.10),
hi,c	=	výška (plocha) píku vnútorného štandardu v kalibračnom roztoku (3.10),
hd,s	=	výška (plocha) píku diklazurilu v roztoku vzorky (5.2.2),
hi,s	=	výška (plocha) píku vnútorného štandardu v roztoku vzorky (5.2.2),
cd,c	=	koncentrácia diklazurilu v kalibračnom roztoku v μg/ml (3.10),
m	=	hmotnosť navážky vzorky v g,
V	=	objem extraktu vzorky podľa 5.2.2 (t. j. 25 ml),
p	=	nominálny obsah diklazurilu v mg/kg v premixe.

7.   Validácia výsledkov

7.1.   Zhodnosť

Zhodnosť analytu môžeme potvrdiť kochromatografiou alebo použitím detektora diódového poľa, pomocou ktorého porovnáme spektrá extraktu vzorky (5.2.1 alebo 5.2.2) a kalibračného roztoku (3.10).

7.1.1.   Kochromatografia

Do extraktu vzorky (5.2.1 alebo 5.2.2) sa pridá vhodné množstvo kalibračného roztoku (3.10). Množstvo pridaného diklazurilu má byť podobné odhadovanému množstvu diklazurilu, zistenému v extrakte vzorky.

Vzhľadom na pridané množstvo a riedenie extraktu sa zvýši len výška píku diklazurilu. Šírka píku, v polovici jeho maximálnej výšky, musí byť v rozmedzí ± 10 % pôvodnej šírky píku diklazurilu alebo píku vnútorného štandardu v extrakte vzorky, do ktorého nebol diklazuril dodatočne pridaný.

7.1.2.   Detekcia detektorom diódového poľa

Výsledky sa vyhodnotia podľa týchto kritérií:

a)	vlnové dĺžky maximálnej absorbancie spektra vzorky a spektra štandardu zaznamenané na vrchole píku chromatogramu musia byť rovnaké s toleranciou určenou rozlišovacou schopnosťou detekčného systému. V prípade detekcie detektorom diódového poľa sa obyčajne pohybuje v rozsahu ± 2 nm;

b)

spektrá vzorky a štandardu zaznamenané na vrchole píku chromatogramu nesmú byť odlišné v častiach spektra medzi 230 a 320 nm v rozsahu od 10 % až 100 % relatívnej absorbancie. Toto kritérium je splnené, keď sú prítomné tie isté maximá, a ak v žiadnom pozorovanom bode nepresiahne odchýlka medzi dvomi spektrami 15 % absorbancie analytu štandardu;

c)

spektrá vzostupnej časti, vrcholu a zostupnej časti píku vytvorené extraktom vzorky nesmú byť vzájomne odlišné v častiach spektra medzi 230 a 320 nm v rozsahu 10 % až 100 % relatívnej absorbancie. Toto kritérium je splnené, keď sú prítomné tie isté maximá a ak vo všetkých pozorovaných bodoch odchýlka medzi spektrami nepresiahne 15 % absorbancie spektra vrcholu píku.

Ak niektoré z týchto kritérií nebude splnené, potom prítomnosť analytu nebola potvrdená.

7.2.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

—	30 % relatívnych z vyššej hodnoty pre obsah diklazurilu od 0,5 mg/kg do 2,5 mg/kg,

—	0,75 mg/kg pre obsah diklazurilu medzi 2,5 mg/kg a 5 mg/kg,

—	15 % relatívnych z vyššej hodnoty pre obsah diklazurilu, ktorý je vyšší ako 5 mg/kg.

7.3.   Návratnosť

Pre vzorky s prídavkom diklazurilu (slepá vzorka) musí byť návratnosť najmenej 80 %.

8.   Výsledky medzilaboratórnej štúdie

Vykonala sa medzilaboratórna štúdia, v rámci ktorej 11 laboratórií analyzovalo 5 vzoriek. Vzorky pozostávali z dvoch premixov; jeden s organickou matricou (O 100) a druhý s anorganickou (A 100). Teoretický obsah diklazurilu bol 100 mg/kg. Tri zmesi krmív pre hydinu pochádzali od troch rôznych výrobcov (NL) (L1/Z1/K1). Teoretický obsah diklazurilu bol 1 mg/kg. Laboratóriá dostali pokyn analyzovať každú vzorku jeden, príp. dvakrát. (Viac informácií o tejto medzilaboratórnej štúdii je uvedených v Úradnom vestníku AOAC International, zväzok 77, č. 6, 1994, s. 1 359 – 1 361). Výsledky sa nachádzajú v nasledujúcej tabuľke.

	Vzorka 1 A 100	Vzorka 2 O 100	Vzorka 3 L1	Vzorka 4 Z1	Vzorka 5 K1
L	11	11	11	11	6
n	19	18	19	19	12
Priemer	100,8	103,5	0,89	1,15	0,89
Sr (mg/kg)	5,88	7,64	0,15	0,02	0,03
CVr ( %)	5,83	7,38	17,32	1,92	3,34
SR (mg/kg)	7,59	7,64	0,17	0,11	0,12
CVR ( %)	7,53	7,38	18,61	9,67	13,65
Nominálny obsah (mg/kg)	100	100	1	1	1

L	=	počet laboratórií
n	=	počet jednotlivých hodnôt
Sr	=	smerodajná odchýlka opakovateľnosti
CVr	=	variačný koeficient opakovateľnosti
SR	=	smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti
CVR	=	variačný koeficient reprodukovateľnosti

9.   Poznámky

Odozva diklazurilu musí vykazovať linearitu v celom koncentračnom rozsahu merania.

G.   STANOVENIE LASALOCIDU SODNÉHO

Sodná soľ polyéteru monokarboxylovej kyseliny produkovanej mikroorganizmom Streptomyces lasaliensis

1.   Účel a oblasť

Táto metóda umožňuje stanoviť obsah lasalocidu sodného v krmivách a v premixoch. Detekčný limit je 5 mg/kg, limit kvantifikácie je 10 mg/kg.

2.   Podstata metódy

Lasalocid sodný sa vyextrahuje zo vzorky do okysleného metanolu a stanoví sa na reverznej fáze vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) pomocou fluorescenčného detektora.

3.   Chemikálie

3.1.	Dihydrogénfosforečnan draselný (KH2PO4)

3.2.	Kyselina ortofosforečná, w (w/w) = 85 %

3.3.	Roztok kyseliny ortofosforečnej c = 20 % Zrieďte 23,5 ml kyseliny ortofosforečnej (3.2) vodou na objem 100 ml.

3.4.	6-metyl-2-heptylamín (1,5-dimetylhexylamín), w (w/w) = 99 %

3.5.	Metanol, čistoty HPLC

3.6.	Kyselina chlorovodíková, hustota c = 1,19 g/ml

3.7.	Fosfátový pufer, roztok c = 0,01 mol/l Rozpustite 1,36 g KH2PO4 (3.1) v 500 ml vody (3.11), pridajte 3,5 ml kyseliny ortofosforečnej (3.2) a 10,0 ml 6-metyl-2-heptylamínu (3.4). Upravte pH na 4,0 roztokom kyseliny ortofosforečnej (3.3) a zrieďte vodou na objem 1 000 ml (3.11).

3.8.	Okyslený metanol Do 1 000 ml odmernej banky preneste 5,0 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.6), doplňte po značku metanolom (3.5) a premiešajte. Tento roztok sa musí pripravovať čerstvo pred použitím.

3.9.	HPLC mobilná fáza, roztok fosfátového pufra a metanolu v pomere 5 + 95 (V + V) Zmiešajte 5 ml roztoku fosfátového pufra (3.7) s 95 ml metanolu (3.5).

3.10.

Štandardná látka lasalocid sodný so zaručenou čistotou, C34H53O8Na (sodná soľ polyéteru monokarboxylovej kyseliny produkovaná mikroorganizmom Streptomyces lasaliensis), E763

3.10.1.

Štandardný zásobný roztok lasalocidu sodného, 500 g/ml Navážte 50 mg lasalocidu sodného (3.10) s presnosťou na 0,1 mg do 100 ml odmernej banky, rozpustite v okyslenom metanole (3.8), doplňte po značku okysleným metanolom a premiešajte. Tento roztok sa musí pripravovať čerstvo pred použitím.

3.10.2.

Pracovný štandardný roztok lasalocidu sodného, 50 μg/ml Do 100 ml odmernej banky napipetujte 10,0 ml zásobného štandardného roztoku (3.10.1), doplňte okysleným metanolom po značku (3.8) a premiešajte. Tento roztok sa musí pripravovať čerstvo pred použitím.

3.10.3.

Kalibračné roztoky Do série 50 ml odmerných baniek preneste 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 a 10,0 ml pracovného štandardného roztoku (3.10.2). Doplňte po značku okysleným metalonom (3.8) a premiešajte. Jednotlivé roztoky zodpovedajú 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 a 10,0 μg/ml lasalocidu sodného. Tieto roztoky sa musia pripravovať čerstvo pred použitím.

3.11.

Voda, čistoty HPLC

4.   Prístrojové vybavenie

4.1.	Ultrazvukový kúpeľ (alebo vodný kúpeľ s trepaním) s regulátorom teploty

4.2.	Membránové filtre, 0,45 μm

4.3.	HPLC zariadenie so vstrekovacím systémom, vhodné na vstrekovanie objemov 20 μl.

4.3.1.

Kvapalinová chromatografická kolóna 125 mm × 4 mm, reverzná fáza s náplňou C18, 5 μm alebo ekvivalentná

4.3.2.

Spektrofluorimeter s nastaviteľnou vlnovou dĺžkou excitácie a emisie vlnových dĺžok

5.   Postup

5.1.   Všeobecné pokyny

5.1.1.   Slepá vzorka

Na kontrolu neprítomnosti lasalocidu sodného a interferujúcich látok sa analyzuje slepá vzorka krmiva pre test návratnosti (5.1.2). Zloženie slepej vzorky má zodpovedať skúmanej vzorke a pri analýze sa nesmie dokázať prítomnosť lasalocidu sodného alebo interferujúcich látok.

5.1.2.   Test návratnosti

Vykonajte test návratnosti pomocou analýzy slepej vzorky krmiva, do ktorej bolo pridané obdobné množstvo lasalocidu sodného, aké sa nachádza vo vzorke. K doplneniu na úroveň 100 mg/kg lasalocidu sodného preneste 10,0 ml zásobného štandardného roztoku (3.10.1) do 250 ml kužeľovej banky a nechajte roztok odpariť na objem približne 0,5 ml. Pridajte 50 g slepej vzorky, dôkladne premiešajte a nechajte 10 minút pred uskutočnením extrakcie (5.2) stáť za občasného premiešania.

Ak nie je dostupná slepá vzorka zodpovedajúca zložením skúmanej vzorke (pozri bod 5.1.1), test návratnosti sa môže vykonať metódou pridávania štandardu. V tomto prípade sa vzorka, ktorá má byť analyzovaná, obohatí množstvom lasalocidu sodného, ktoré je podobné množstvu prítomnému vo vzorke. Táto vzorka sa analyzuje spolu s neobohatenou vzorkou a návratnosť sa vypočíta odčítaním.

5.2.   Extrakcia

5.2.1.   Krmivo

Navážte 5 g až 10 g vzorky s presnosťou na 0,01 g do 250 ml kužeľovej banky s uzáverom. Pipetou pridajte 100,0 ml okysleného metanolu (3.8). Voľne uzavrite a krúživým pohybom jej obsah premiešajte. Umiestnite banku na 20 minút do ultrazvukového kúpeľa (4.1) pri približne 40 oC, potom ju vyberte a ochlaďte na laboratórnu teplotu. Nechajte odstáť približne 1 hodinu, kým sa suspendovaná látka neusadí, a potom alikvotnú časť prefiltrujte cez 0,45 μm membránový filter (4.2) do vhodnej nádoby. Prejdite k ďalšiemu kroku, ktorým je stanovenie pomocou HPLC (5.3).

5.2.2.   Premixy

Navážte s presnosťou na 0,001 g približne 2 g nepomletého premixu do 250 ml odmernej banky. Pipetou pridajte 100,0 ml okysleného metanolu (3.8) a krúživým pohybom premiešajte. Umiestnite banku s jej obsahom na 20 minút do ultrazvukového kúpeľa (4.1) pri približne 40 oC, potom ju vyberte a ochlaďte na laboratórnu teplotu. Doplňte po značku okysleným metanolom (3.8) a dôkladne premiešajte. Nechajte 1 hodinu odstáť, kým sa suspendovaná látka neusadí, a potom alikvotnú časť prefiltrujte cez 0,45 μm membránový filter (4.2). Rozrieďte primeraný objem číreho filtrátu okysleným metanolom (3.8), čím získate konečný skúšobný roztok, ktorý obsahuje približne 4 μg/ml lasalocidu sodného. Prejdite k ďalšiemu kroku, ktorým je stanovenie pomocou HPLC (5.3).

5.3.   Stanovenie HPLC

5.3.1.   Parametre

Odporúčané sú nasledujúce podmienky, iné podmienky sa môžu použiť, ak zabezpečia dosiahnutie ekvivalentných výsledkov:

Kolóna na kvapalinovú chromatografiu (4.3.1):	125 mm × 4 mm, reverzná fáza s náplňou C18, 5 μm alebo ekvivalentná
Mobilná fáza (3.9):	zmes roztoku fosfátového pufra (3.7) a metanolu (3.5), v pomere 5 + 95 (V + V)
Prietoková rýchlosť:	1,2 ml/min.
Detekčná vlnová dĺžka:
Excitácia:	310 nm
Emisia:	419 nm
Vstrekový objem:	20 μl

Skontrolujte stabilitu chromatografického systému tak, že niekoľkokrát nastreknete kalibračný roztok (3.10.3) obsahujúci 4,0 μg/ml, kým nedosiahnete konštantné výšky (alebo plochy) píkov a konštantné retenčné časy.

5.3.2.   Kalibračný graf

Nastreknite každý kalibračný roztok (3.10.3) niekoľkokrát a zmerajte výšky (plochy) píkov pre každú koncentráciu. Zostrojte kalibračný graf, pričom použite priemerné výšky (plochy) píkov ako ordináty (os y) a príslušné koncentrácie v μg/ml ako abscisy (os x).

5.3.3.   Roztok vzorky

Nastreknite extrakty vzoriek získané podľa 5.2.1 alebo 5.2.2 niekoľkokrát, použitím rovnakého objemu, ako bol odobratý pre kalibračný roztok, a stanovte priemerné výšky (plochy) píkov pre hodnoty píkov lasalocidu sodného.

6.   Výpočet výsledkov

Z priemernej výšky (plochy) píku získanej nastreknutím roztoku vzorky (5.3.3) stanovte koncentráciu lasalocidu sodného (μg/ml) porovnaním s kalibračným grafom.

6.1.   Krmivá

Obsah w lasalocidu sodného (mg/kg) vzorky sa vypočíta podľa tohto vzorca:

[mg/kg]

kde:

c	=	koncentrácia lasalocidu sodného v roztoku vzorky (5.2.1) v μg/ml,
V1	=	objem extraktu vzorky podľa 5.2.1 v ml (t. j. 100),
m	=	hmotnosť navážky vzorky v g.

6.2.   Premixy

Obsah w lasalocidu sodného (mg/kg) sa vypočíta podľa tohto vzorca:

[mg/kg]

kde:

c	=	koncentrácia lasalocidu sodného v roztoku vzorky (5.2.2) v μg/ml,
V2	=	objem extraktu vzorky podľa 5.2.2 v ml (t. j. 250),
f	=	faktor zriedenia podľa 5.2.2,
m	=	hmotnosť navážky vzorky v g.

7.   Validácia výsledkov

7.1.   Zhodnosť

Metódy založené na spektrofluorometrii podliehajú interferencii v menšej miere ako metódy, pri ktorých sa používa UV detekcia. Zhodnosť analytu môžeme potvrdiť kochromatografiou.

7.1.1.   Kochromatografia

Do extraktu vzorky (5.2.1 alebo 5.2.2) sa pridá vhodné množstvo kalibračného roztoku (3.10.3). Množstvo pridaného lasalocidu sodného musí byť podobné množstvu lasalocidu sodného, zistenému v extrakte vzorky. Iba výška píku lasalocidu sodného sa má zvýšiť v závislosti od množstva pridaného lasalocidu sodného a od zriedenia extraktu. Šírka píku v polovičnej výške musí byť v rozsahu ± 10 % pôvodnej šírky píku vytvorenej neobohateným extraktom vzorky.

7.2.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť:

—	15 % relatívnych z vyššej hodnoty pre obsah lasalocidu sodného od 30 mg/kg do 100 mg/kg,

—	15 mg/kg pre obsah lasalocidu sodného od 100 mg/kg do 200 mg/kg,

—	7,5 % relatívnych z vyššej hodnoty pre obsah lasalocidu sodného nad 200 mg/kg.

7.3.   Návratnosť

V prípade obohatenej (slepej) vzorky krmiva má byť návratnosť najmenej 80 %. V prípade obohatenej vzorky premixu má byť návratnosť najmenej 90 %.

8.   Výsledky medzilaboratórnej štúdie

Vykonala sa medzilaboratórna štúdia (6), v rámci ktorej 12 laboratórií analyzovalo 2 premixy (vzorky 1 a 2) a 5 krmív (vzorky 3 – 7). Každá vzorka sa analyzovala dvakrát. Výsledky sú uvedené v tejto tabuľke:

	Vzorka 1 Premixy pre kurčatá	Vzorka 2 Premixy pre morky	Vzorka 3 Granule pre morky	Vzorka 4 Granulované krmivo pre kurčatá	Vzorka 5 Krmivo pre morky	Vzorka 6 Krmivo pre hydinu A	Vzorka 7 Krmivo pre hydinu B
L	12	12	12	12	12	12	12
n	23	23	23	23	23	23	23
priemer [mg/kg]	5 050	16 200	76,5	78,4	92,9	48,3	32,6
sr [mg/kg]	107	408	1,71	2,23	2,27	1,93	1,75
CVr [ %]	2,12	2,52	2,24	2,84	2,44	4,00	5,37
sR [mg/kg]	286	883	3,85	7,32	5,29	3,47	3,49
CVR [ %]	5,66	5,45	5,03	9,34	5,69	7,18	10,70
Nominálny obsah [mg/kg]	5 000 (7)	16 000 (7)	80 (7)	105 (7)	120 (7)	50 (8)	35 (8)

L	=	počet laboratórií
n	=	počet jednotlivých výsledkov
sr	=	smerodajná odchýlka opakovateľnosti
sR	=	smerodajná odchýlka reprodukovateľnosti
CVr	=	variačný koeficient opakovateľnosti, %
CVR	=	variačný koeficient reprodukovateľnosti, %

---

(1)  Vykonala pracovná skupina v oblasti krmív Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(2)  Vykonala pracovná skupina v oblasti krmív Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(3)  Môžu sa použiť iné metódy digescie za predpokladu, že sa dokázalo, že majú podobné výsledky (ako mikrovlnná tlaková digescia).

(4)  Zelené krmivo (čerstvé alebo sušené) môže obsahovať veľké množstvá kremičitanu, v ktorom sa môžu uchovávať mikroprvky a ktorý sa musí odstrániť. V prípade vzoriek týchto krmív sa preto musí postupovať podľa nasledujúceho upraveného postupu: vykonajte krok 5.1.1.1 po filtráciu. Dvakrát premyte filtračný papier obsahujúci nerozpustné rezíduum vriacou vodou a vložte ho do kremenného alebo platinového téglika. Spaľujte v muflovej peci (4.1) pri teplote pod 550 oC, kým sa všetok uhlíkatý materiál úplne nestratí. Nechajte vychladnúť, pridajte niekoľko kvapiek vody, potom 10 až 15 ml kyseliny fluorovodíkovej (3.4) a odparte dosucha pri teplote približne 150 oC. Ak vo zvyšku zostane akýkoľvek kremičitan, znovu ho rozpustite v niekoľkých mililitroch kyseliny fluorovodíkovej (3.4) a odparte dosucha. Pridajte päť kvapiek kyseliny sírovej (3.5) a zahrievajte, kým sa neprestanú uvoľňovať biele výpary. Po pridaní 5 ml 6 mol/liter kyseliny chlorovodíkovej (3.2) a približne 30 ml vody tento roztok zahrejte, prefiltrujte ho do 250 ml odmernej banky a doplňte po značku vodou (koncentrácia chlorovodíka približne 0,5 mol/l). Ďalej pokračujte v postupe stanovenia obsahu mikroprvkov od bodu 5.1.2.

(5)  The Analyst 108, 1983, str. 1 252 až 1 256.

(6)  Analyst, 1995, 120, 2175-2180.

(7)  Obsah deklarovaný výrobcom.

(8)  Krmivo pripravené v laboratóriu.