PRILOGA I

Kvantitativna določitev vsebnosti škroba in njegovih produktov razgradnje, vključno z glukozo

1.   NAMEN IN PODROČJE UPORABE

(a)	Metoda omogoča kvantitativno določanje vsebnosti škroba in njegovih produktov razgradnje, vključno z glukozo, v nadaljnjem besedilu „škrob“.

(b)	Vsebnost „škroba“ iz točke (a) je enaka vrednosti E, izračunani, kakor je podano v točki 6(a) opisane metode.

2.   PRINCIP

Vzorec se razklopi z natrijevim hidroksidom in „škrob“ razpade na glukozne enote z amilazo glukozidazo. Glukozo določimo z encimskim postopkom.

3.   REAGENTI

(uporablja se dvakrat destilirana voda)

3.1   0,5 N raztopina natrijevega hidroksida (0,5 mol/l).

3.2   96 % (minimalno) led-ocetna kislina.

3.3   Raztopina amilaze glukozidaze:

tik pred uporabo 10 mg amilaze glukozidaze (EC 3.2.1.3) (60 U/mg) raztopimo v 1 ml vode (1).

3.4   Puferska raztopina trietanolamina:

14,0 g trietanolamin hidroklorida [tris(2-hidroksietil)amonijev klorid] in 0,25 g magnezijevega sulfata (MgSO47H2O) raztopimo v 80 ml vode, dodamo približno 5 ml 5 N raztopine natrijevega hidroksida (5 mol/l) in z 1 N raztopine natrijevega hidkroksida (1 mol/l) uravnamo pH na 7,6.

Z vodo dopolnimo do 100 ml. Pufersko raztopino lahko hranimo najmanj štiri tedne pri temperaturi 4 °C.

3.5   Raztopina NADP (nikotinamid adenin dinukleotid fosfat, di-natrijeva sol):

60 mg NADP raztopimo v 6 ml vode. To raztopino lahko hranimo najmanj štiri tedne pri temperaturi 4 °C.

3.6   Raztopina ATP (adenozin-5′-trifosfat, di-natrijeva sol):

300 mg ATP. 3H2O in 300 mg natrijevega hidrogen karbonata (NaHCO3) raztopimo v 6 ml vode. To raztopino lahko hranimo najmanj štiri tedne pri temperaturi 4 °C.

3.7   Suspenzija HK/G6P-DH (heksokinaza (EC 2.7.1.1) in glukoza-6-fosfat-dehidrogenaza (EC 1.1.1.49):

280 U HK in 140 U G6P-DH suspendiramo v 1 ml 3,2 M raztopine amonijevega sulfata. To suspenzijo lahko hranimo najmanj eno leto pri temperaturi 4 °C.

4.   APARATURA

4.1   Vodna kopel s temperaturo 60 °C z magnetnim mešalnikom.

4.2   Magnetne palice.

4.3   UV-spektrofotometer z 1 cm kivetami.

4.4   Pipete za encimsko analizo.

5.   METODA

5.1   Vzorec operemo z etanolom, raztopimo v natrijevem hidroksidu in „škrob“ podvržemo encimski hidrolizi

5.1.1

Glede na predvideno vsebnost „škroba“ (vsebnost „škroba“ ne sme presegati 0,4 g na vzorec) izberemo naslednje mase vzorca: Predvidena vsebnost „škroba“ v izdelku, v g/100g Približna masa vzorca, v g (p) Volumen merilne bučke, v ml Faktor razredčenja do 1 litra (f) > 70 0,35–0,4 500 2 20–70 največ 0,5 500 2 5–20 največ 1 250 4 < 5 največ 2 200 5

5.1.2

Natehtamo vzorec s točnostjo 0,1 mg.

5.1.3

Dodamo 50 ml 0,5 N raztopine natrijevega hidroksida (točka 3.1) in na vodni kopeli (točka 4.1) pri 60 °C z magnetnim mešalnikom nepretrgoma mešamo 30 minut.

5.1.4

Dodamo nekoliko ml koncentrirane ocetne kisline (točka 3.2) in pH naravnamo na 4,6 do 4,8.

5.1.5

Postavimo na vodno kopel z magnetnim mešalnikom (točka 4.1) pri 60 °C, dodamo 1,0 ml encimske raztopine (točka 3.3) in med nepretrganim mešanjem pustimo reagirati 30 minut.

5.1.6

Po ohladitvi vzorec kvantitativno prenesemo v merilno bučko (točka 5.1.1) in dopolnimo z vodo do oznake.

5.1.7

Če je treba, prefiltriramo skozi nagubani filtrirni papir (glej opombo 1).

5.2   Kvantitativno določanje glukoze

5.2.1

Raztopina vzorca mora vsebovati 100 do 1 000 mg glukoze na liter, kar ustreza ΔΕ340 med 0,1 in 1,0. Absorbanca raztopine vzorca pri faktorju razredčenja 1 + 30 z vodo, ne sme preseči 0,4 (izmerimo proti zraku) pri 340 nm.

5.2.2

Raztopino pufra (točka 3.4) segrejemo do sobne temperature (20 °C).

5.2.3

Temperatura reagentov in vzorca mora biti med 20 in 25 °C.

5.2.4

Izmerimo absorbanco pri 340 nm proti zraku (t. j. brez referenčne kivete).

5.2.5

Nadaljujemo pipetiranje v skladu s tabelo: V kiveto vlijemo Kontrola (ml) Vzorec (ml) Pufer (reagent 3.4) 1,00 1,00 NADP (reagent 3.5) 0,10 0,10 ATP (reagent 3.6) 0,10 0,10 Raztopina vzorca (5.1.6 ali 5.1.7) — 0,10 Dvojno destilirana voda 2,00 1,90 Raztopine premešamo in po treh minutah izmerimo njihovo absorbanco (E1). Sprožimo reakcijo z dodatkom: HK/G6P.DH (reagent 3.7) 0,02 0,02 Raztopine premešamo, pustimo do popolne reakcije (približno 15 minut) in izmerimo njihovo absorbanco (E2). Če reakcija po 15 minutah ni bila končana, nadaljujemo merjenje absorbance v5-minutnih intervalih do konstantne vrednosti. Nato ekstrapoliramo nazaj do časa dodatka suspenzije reagenta iz točke 3.7 (glej opombo 2).

5.2.6

Izračunamo razlike absorbance med slepim poskusom in vzorcem (E2–E1). Odštejemo razliko absorbance slepega poskusa (ΔΕ slepega poskusa) od razlike absorbance vzorca (ΔΕ vzorca): ΔΕ = ΔΕ vzorca – ΔΕ slepega poskusa Ta razlika pomeni vsebnost glukoze v raztopini vzorca: vsebnost glukoze v raztopini vzorca, g/l Gl = ((3,22 × 180,16)/(6,3 × 1 × 0,1 × 1 000)) × ΔΕ340 = 0,921 × ΔΕ340 (3,22 = volumen merjene raztopine; 1 = dolžina kivete; 0,1 = volumen raztopine; molekulska masa glukoze je 180,16 (g/mol))

5.2.7

Če iz kakršnega koli razloga meritve pri 340 nm niso mogoče, lahko meritve izvedemo na valovnih dolžinah 365 nm ali 334 nm, pri čemer se številka 6,3 v zgornji formuli za Gl nadomesti s številko 3,5 ali 6,18.

6.   IZRAČUN IN IZRAŽANJE REZULTATOV

(a)	E = vsebnost „škroba“ v g/100 g: E = ((100 × 0,9 × Gl)/(p × f))

(b)	Z = vsebnost „glukoze“ v g/100 g: Z = ((100 × Gl)/(p × f))

pri čemer je:

Gl	=	glukoza v g/l (5.2.6);
F	=	faktor razredčenja (5.1.1);
P	=	masa vzorca v g;
0,9	=	pretvorbeni faktor za škrob.

Opombe:

1.	Če raztopine vzorca ni mogoče filtrirati v skladu s točko 5.1.7, uporabimo drugo ustrezno metodo, da dobimo čisto raztopino.

2.	Ob inhibiciji encimov se priporoča, da se uporabi metoda, pri kateri se dodajo znane količine čistega škroba.

---

(1)  U je mednarodna enota za aktivnost encimov.

PRILOGA II

Kvantitativno določanje vsebnosti škroba ali dekstrina ali drugih modificiranih škrobov v izdelkih pod oznakami KN 3505 20 10 do 3505 20 90 in vsebnosti škrobnih snovi v izdelkih pod oznakami KN 3809 10 10 do 3809 10 90

I.   PRINCIP

Škrob se s kislinsko hidrolizo pretvori v reducirajoče sladkorje, ki se določijo volumetrično s Fehlingovo raztopino.

II.   APARATURA IN REAGENTI

1.	250 ml bučka;

2.	200 ml merilna bučka;

3.	25 ml graduirana bireta;

4.	klorovodikova kislina z gostoto 1,19;

5.	raztopina kalijevega hidroksida;

6.	aktivno oglje za razbarvanje;

7.	Fehlingova raztopina;

8.	metilenmodro – raztopina (1 %).

III.   METODA

Vzorec, ki vsebuje približno 1 g škroba, prenesemo v 250 ml bučko. Dodamo 100 ml destilirane vode in 2 ml klorovodikove kisline. Vsebino zavremo in pustimo vreti 3 ure pod povratnim hladilnikom.

Vsebino iz bučke in vodo za izpiranje prelijemo v merilno bučko 200 ml. Ohladimo in nato skoraj nevtraliziramo z raztopino kalijevega hidroksida. Nato z destilirano vodo dopolnimo do 200 ml ter prefiltriramo prek aktivnega oglja za razbarvanje.

Raztopino prelijemo v graduirano bireto, nato reduciramo 10 ml Fehlingove raztopine z naslednjo metodo:

V 250 ml bučko z ravnim dnom nalijemo 10 ml Fehlingove raztopine (5 ml raztopine A in 5 ml raztopine B). Bučko stresamo, dokler se tekočina ne zbistri, nato dodamo 40 ml destilirane vode in malo kremenjaka ali plovca.

Bučko postavimo na pravokotno azbestno mrežico, ki ima na sredini okroglo odprtino s premerom približno 6 cm, azbest pa je na žični mreži. Bučko segrejemo tako hitro, da začne tekočina vreti po približno 2 minutah.

Iz birete v vrelo tekočino postopoma dodajamo raztopino sladkorja tako dolgo, da modra barva Fehlingove raztopine postane komaj opazna; nato kot indikator dodamo 2 do 3 kapljice raztopine metilenmodrega in titracijo končamo z dodajanjem preostale količine raztopine sladkorja po kapljicah, dokler modra barva indikatorja ne izgine.

Za večjo točnost titracijo ponovimo pod istimi pogoji, vendar tako, da brez prekinitve dodamo skoraj vso raztopino sladkorja, potrebno za redukcijo Fehlingove raztopine. Pri tej drugi titraciji bi morala biti redukcija Fehlingove raztopine končana v treh minutah. Raztopino pustimo vreti še točno dve minuti, pri čemer eno minuto v vrelo raztopino po kapljicah dodajamo reagent, dokler modra barva ne izgine.

Odstotni masni delež škroba v vzorcu določimo z naslednjo formulo:

škrob % = ((T × 200 × 100)/(n × p)) × 0,95

pri čemer je:

T	=	količina brezvodne dekstroze v gramih, ki ustreza 10 ml Fehlingove raztopine (5 ml raztopine A in 5 ml raztopine B). Ta titer ustreza 0,04945 g brezvodne dekstroze, če raztopina A vsebuje 17,636 g bakra na liter;
n	=	število ml raztopine sladkorja, ki je bila porabljena pri titraciji;
p	=	masa vzorca;
0,95	=	pretvorbeni faktor brezvodne dekstroze v škrob.

IV.   PRIPRAVA FEHLINGOVIH RAZTOPIN

Raztopina A	:	v merilni bučki v destilirani vodi raztopimo 69,278 g čistega kristalnega bakrovega sulfata – p. a. (CuSO4 5H2O) – brez železa in z destilirano vodo dopolnimo do 1 l. Pravilno koncentracijo te raztopine moramo preveriti s kvantitativno določitvijo bakra.
Raztopina B	:	v merilni bučki v destilirani vodi raztopimo 100 g natrijevega hidroksida in 346 g dvojnega natrij-kalijevega tartara (Rochellova sol) ter z destilirano vodo dopolnimo do 1 l.

Raztopini A in B moramo zmešati v enakih količinah neposredno pred uporabo. Deset ml Fehlingove raztopine (5 ml raztopine A in 5 ml raztopine B) pod pogoji, ki so opisani v točki III, popolnoma reducira 0,04945 g brezvodne dekstroze.

PRILOGA III

Ugotavljanje navadne bele moke ali zdroba v makaronih, špagetih in podobnih izdelkih (testenine)

(Youngova in Gillesova metoda, prilagojena po Bernaertsu in Grunerju)

I.   PRINCIP

Iz analiznega vzorca testenine pripravimo ekstrakt z uporabo nepolarnega topila.

Ekstrakt kromatografiramo na tanki plasti silikagela, da se ločijo steroli v različnih frakcijah.

Glede na število jasno obarvanih trakov lahko določimo, ali je bil preiskovani izdelek narejen izključno iz moke durum ali iz navadne moke ali mešanice obeh. Prav tako lahko določimo, ali so bila dodana jajca.

II.   APARATURA IN REAGENTI

1.	Mešalec ali drobilec, s katerim dobimo zdrobljene delce, ki preidejo skozi sito z velikostjo odprtin 0,200 mm.

2.	Standardno sito z velikostjo odprtin 0,200 mm.

3.	Vodna kopel ali uparjalnik pod znižanim tlakom.

4.	Steklena plošča, aluminijeva folija ali druga primerna podlaga velikosti 20 × 20 cm, prekrita s tanko plastjo silikagela. Če moramo pripraviti tanko plast, uporabimo silikagel s 13 % utrjevalca, ki ga s primerno aparaturo, v skladu z navodili proizvajalca, nanesemo v 0,25 mm tankem sloju.

5.	Mikropipeta za 20 mikrolitrov.

6.	Posoda s pokrovom za razvijanje kromatogramov.

7.

Atomizer.

8.	Petroleter, vrelišče med 40 in 60 °C, pred uporabo ga redestiliramo.

9.	Brezvodni etileter p. a.

10.	Tetraklorogljik za kromatografijo, pred uporabo ga redestiliramo.

11.	Eosformolibdenova kislina p. a.

12.	Etilni alkohol 94°.

III.   METODA

Približno 20 g vzorca zdrobimo tako, da vso količino presejemo skozi sito. Vzorec prenesemo v erlenmajerico in pokrijemo s 150 ml petroletra. Pustimo stati pri sobni temperaturi do naslednjega dne. Pri tem od časa do časa premešamo.

Filtriramo skozi Büchnerjev lijak s filtrirnim sredstvom ali skozi lonček s sintranim dnom. Postopoma prenesemo tako dobljeno bistro raztopino v merilno bučko 100 ml. Topilo odstranimo s segrevajem bučke na vodni kopeli pod znižanim tlakom pri 40 do 50 °C. Po končanem odparevanju bučko segrevamo pod znižanim tlakom še nadaljnjih deset minut.

Bučko ohladimo in določimo maso ekstrakta. Ekstrakt raztopimo v etiletru tako, da dodamo 1 ml etiletra na vsakih 60 mg ekstrakta.

Medtem aktiviramo tanke plasti tako, da jih tri ure segrevamo pri 130 °C. Ohladimo jih v eksikatorju, v katerem je silikagel. Plošče, ki jih ne uporabimo takoj, lahko hranimo v istem eksikatorju.

Po kapljicah dodajamo po 20 mikrolitrov bistre raztopine tako, da v na novo aktivirani plasti dobimo 3 cm dolg trak konstantne širine. Pustimo, da topilo odpari.

Kromatogram razvijemo s tetraklorogljikom pri normalni temperaturi v posodi za razvijanje kromatogramov, katere stene so pokrite s filtrirnim papirjem, prepojenim s topilom. Po približno eni uri topilo doseže višino 18 cm. Ploščo odstranimo iz posode in pustimo, da topilo odpari na zraku. Če želimo boljšo ločitev trakov, ponovimo razvijanje kromatograma. Ponovno pustimo, da topilo odpari na zraku.

Tanko plast silikagela obrizgamo z 20 % raztopino fosformolibdenove kisline v etilnem alkoholu. Barva tanke plasti mora biti enakomerno rumena. Trakove razvijemo tako, da obrizgano ploščo segrevamo pet minut pri 110 °C.

IV.   INTERPRETACIJA KROMATOGRAMOV

Če se na kromatogramu pojavi samo en svetleč obarvan trak z Rf-vrednostjo med 0,4 in 0,5, je bila za pripravo testenine uporabljena durum pšenica. Če se, po drugi strani, pojavita dva trakova enakega sijaja, je bila uporabljena surovina navadna moka. Mešanico durum in navadne moke lahko ocenimo na podlage relativnega sijaja dveh trakov.

Če se pojavijo trije trakovi (dva na višini, kjer naj bi bila glavna trakova navadne pšenice, s tretjim trakom med njima), so bila testeninam dodana jajca. V takem primeru je bila surovina durum moka, če je srednji trak sijajnejši od zgornjega traku. Po drugi strani pa, če je zgornji trak sijajnejši od srednjega, je bila surovina navadna moka.

PRILOGA IV

Razveljavljena uredba z njeno spremembo

Uredba Komisije (EGS) št. 4154/87	(UL L 392, 31.12.1987, str. 19)
Uredba Komisije (ES) št. 203/98	(UL L 21, 28.1.1998, str. 6)

PRILOGA V

Primerjalna tabela

Uredba (EGS) št. 4154/87	Ta uredba
Členi 1 do 4	Členi 1 do 4
Člen 5	—
—	Člen 5
Člen 6	Člen 6
Priloge I, II in III	Priloge I, II in III
—	Priloga IV
—	Priloga V