Deoksiribonukleorūgštis

Deoksiribonukleorūgštis (DNR) – nukleorūgštis, esanti kiekvienoje eukariotinėje ląstelėje, daugiausia jos branduolyje. Joje (jos azotinių bazių sekoje) yra tripletiniu kodu užkoduota genetinė informacija, kuri perduodama dalijimosi metu naujoms ląstelėms, o per lytines ląsteles – individo palikuonims.

Deoksiribonukleorūgštis susideda iš deoksiribonukleotidų. Deoksiribonukleotidas yra sudarytas iš heterociklinės azoto bazės ir angliavandenio deoksiribozės. Deoksinukleotidai skiriasi azoto bazėmis. Pagrindinės yra keturios: adeninas (A), guaninas (G), citozinas (C) ir timinas (T).^[1]

Deoksiribonukleotidai jungiasi į polinukleotidinę grandinę per fosforo rūgšties likutį tam tikru, kiekvienai individualiai deoksiribonukleorūgščiai specifiniu nuoseklumu. Deoksiribonukleorūgšties molekulė (išskyrus kai kurių virusų) susidaro iš 2 polinukleotidinių grandinių, susisukusių į spiralę apie bendrą ašį. Šias 2 grandines jungia vandenilinės jungtys, esančios tarp nukleotidų azoto bazių (pastarosios išsidėsčiusios spiralės viduje; jų plokštuma statmena spiralės ašiai). Adeninas (A) ir Timinas (T) jungiasi dviem vandeniliniais ryšiais, o Guaninas (G) ir Citozinas (C) trim vandeniliniais ryšiais.

DNR molekulė yra tokia plona, kad jos neįmanoma pamatyti net pro galingiausius optinius mikroskopus. DNR grandinė – tai dviguba spiralė, kuri yra panaši į susuktas virvines kopėčias su daugybe pakopų.

Kiekvienos organizmų rūšies DNR yra specifinė – turi skirtingą azotinių bazių kiekių santykį ${A+T \over G+C}$ , arba specifiškumo koeficientą (įvairiuose organizmuose jis svyruoja nuo 0,32 iki 3,04), ir skirtingą bazių seką molekulėje. Būtent įvairuojanti bazių seka grandinėje ir nurodo gyvojo organizmo genetinį kodą, kuris nulemia organizmo ypatybes.

Interfazės metu lastelių ar bakterijų DNR dvigubėja remiantis komplementarumo principu. Dvigubėjant DNR iš pradžių nutrūksta vandeniliniai ryšiai tarp nukleotidų, DNR išsiskiria į dvi dalis, prie abiejų atsiradusių dalių nukleotidų (komplementarumo principu) ima jungtis nauji nukleotidai. Galiausiai visa grandinė tokiu būdu sudvigubėja.

Eukariotinėse (tikrabranduolėse ląstelėse) deoksiribunukleorūgšties galima rasti branduolyje, mitochondrijose, plastidėse.

Veikiama įvairių mutagenų, deoksiribonukleorūgšties struktūra kinta, dėl to dažnai organizme atsiranda mutacijų.

1944 išaiškinta deoksiribonukleorūgšties reikšmė paveldimumui. 1953 Dž. D. Votsonas (JAV) ir F. Krikas (Didžioji Britanija) atskleidė jos sandarą.

DNR išskyrimas

Žmogaus ir gyvūnų DNR molekuliniams genetiniams tyrimams galima išskirti iš:

periferinio kraujo leukocitų; kraujo dėmių (Guthrie kortelės);
choriono gaurelių;
amniocitų;
burnos epitelio ląstelių;
parafininių biopsinių blokų;
plauko su plauko folikulu; odos epitelio ląstelių; spermos (dažniausiai teismo medicinoje).

Nėra sunku išskirti ir augalų bei mikroorganizmų DNR, jei tik turima pakankamai pradinės medžiagos.

DNR yra santykinai chemiškai inertiška molekulė, kadangi aktyvios bazės yra invertuotos į dvigubos spiralės vidų ir apsaugotos inertišku fosfatų ir deoksiribozės karkasu, sujungtu fosfodiesterine jungtimi. Tačiau DNR molekulė nėra atspari fizinėms jėgoms, ypač šoninėms bei hidrodinaminėms. Tirpale dvispiralė DNR yra atsitiktinai susivyniojusi į kamuoliuką, kurį sustiprina vandenilinės jungtys tarp bazių ir elektrostatinis atstūmimas tarp neigiamai įkrautų fosfatinių grupių. Kuo ilgesnė DNR molekulė, tuo silpnesnės hidrodinaminės jėgos gali ją sufragmentuoti. Po standartinių DNR išskyrimo procedūrų dažniausiai gaunamos ~100-150 (200) kb ilgio DNR fragmentų mišinys. Jie tinka Sounthern’o analizei, PGR bei genominių bibliotekų kūrimui naudojant bakteriofagų vektorius. Fiziologinėmis sąlygomis dauguma DNR yra B formos (sukasi palei laikrodžio rodyklę, turi 10 bp (bazių porų) per vieną apsisukimą, apsisukimas lygus 3,4 nm).

Principas

Trys pagrindiniai DNR išskyrimo etapai:

Ląstelių ir branduolio lipidinės membranos suardymas trinant, ultragarsu ar detergentais (SDS – Natrio dodecil/lauryl sulfatas); IGEPAL/NONIDET.
Viduląstelinių ir histoninių baltymų pašalinimas pridėjus proteinazę K ir juos precipituojant pridėjus natrio ar amonio acetato, arba taikant fenolio-chloroformo-(izoamilo alkoholio) išskyrimo etapą (susidaro dvifazis tirpalas: DNR (ir kt. druskos) ištirpsta vandeninėje fazėje, o baltymai lieka organinėje fazėje; žingsniai kartojami; gali būti naudojamas tirpalas 25:24:1).
DNR precipitacija paveikus šaltu 96º etanoliu ar izopropanoliu (izopropilo alkoholiu) (DNR netirpsta alkoholyje ir iškrenta į nuosėdas; taip pat yra pašalinamos druskos)
- Vėliau DNR kelis kartus perplaunama alkoholiu (70, 96º etanoliu) džiovinama ir užpilama TE buferiu (šarminis buferis) arba laikoma -20 ištirpinta etanolyje (DNR bankas).