Quais são as melhores práticas para medir interações proteína-proteína?

1 Escolha o método certo

Diferentes métodos para medir IBPs têm suas próprias vantagens e limitações, como sensibilidade, especificidade, taxa de transferência, escalabilidade e compatibilidade com diferentes amostras e condições. Por exemplo, co-imunoprecipitação (Co-IP) usa anticorpos para isolar e identificar proteínas que interagem com uma proteína-alvo em um lisado celular ou uma amostra de tecido. Purificação por afinidade-espectrometria de massas (AP-MS) combina purificação por afinidade de uma proteína-alvo ou de um complexo proteico com espectrometria de massa para identificar e quantificar as proteínas interagentes. Levedura bi-híbrida (Y2H) usa um sistema de expressão gênica repórter em levedura para detectar a interação entre duas proteínas que são fundidas a diferentes domínios de um fator de transcrição. Transferência de energia de ressonância de fluorescência (TRASTE) usa sondas fluorescentes que emitem ou absorvem luz em diferentes comprimentos de onda para medir a distância e a interação entre duas proteínas em células vivas. Transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET) é semelhante ao FRET, mas usa sondas bioluminescentes que geram luz sem excitação externa para medir a interação entre duas proteínas em células vivas. Assim, é importante considerar qual método melhor se adapta à sua pergunta de pesquisa, desenho experimental e recursos disponíveis ao selecionar o método apropriado para medir IBPs.

2 Otimizar as condições experimentais

Depois de escolher o método para medir IBPs, você deve otimizar as condições experimentais para garantir a qualidade e a reprodutibilidade de seus resultados. Os fatores a serem considerados incluem expressão e purificação de proteínas, usando sistemas de expressão e tampões apropriados para produzir e purificar proteínas com alto rendimento e pureza. Além disso, você deve usar rótulos e métodos de detecção adequados para suas proteínas, dependendo do método que você usa. Também é importante considerar a concentração e a razão da proteína, a composição do tampão e o pH, bem como as configurações de temperatura e tempo, a fim de mimetizar condições fisiológicas ou patológicas, evitar interações ou interferências inespecíficas e minimizar os efeitos das flutuações térmicas ou cinéticas. Verificar a identidade, integridade e atividade de suas proteínas usando técnicas como SDS-PAGE, Western blotting e ensaios enzimáticos é fundamental para obter resultados precisos.

3 Validar e verificar os resultados

Depois de medir seus PPIs, é essencial validar e verificar seus resultados para confirmar a especificidade e relevância deles. Para fazer isso, você deve executar controles positivos e negativos em seus experimentos para avaliar a confiabilidade e a precisão de seu método e dados. Além disso, repetir seus experimentos pelo menos três vezes garantirá a consistência e a reprodutibilidade de seus resultados. Além disso, o uso de múltiplos métodos para medir seus IBPs pode fornecer informações complementares e corroborativas. Além disso, ensaios funcionais podem demonstrar as consequências biológicas e implicações de seus IBPs. Todas essas estratégias podem ajudá-lo a reduzir os vieses e erros de cada método, bem como avaliar a significância e a variação de seus resultados.

4 Veja o que mais considerar

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