Espectrometria de massas: Princípios e aplicações

A espectrometria de massas é uma técnica analítica utilizada para detectar e identificar moléculas de interesse por meio da medição da sua massa e da caracterização de sua estrutura química.

O princípio físico básico de um espectrômetro de massa consiste em criar íons moleculares por um método adequado, separá-los de acordo com a sua relação de massa/carga (m/z) e, por conseguinte, detectá-los qualitativa e quantitativamente por sua respectiva taxa m/z e abundância.

Um espectrômetro de massas nos permite:

• Identificar compostos desconhecidos;
• Quantificar compostos conhecidos;
• Elucidar as propriedades químicas e estruturais de uma molécula;
• Medir a massa molecular de alguns compostos;
• Determinar modificações pós-traducionais de proteínas.

Por conta dos atributos listados acima, a técnica de espectrometria de massas, devidamente hifenada, é frequentemente aplicada, para:

• Análise de resíduos e contaminantes em amostras de alimentos de origem animal e vegetal (Antibióticos, anabolizantes, pesticidas, micotoxinas, dioxinas, traços de metais pesados, etc.)
• Análise de resíduos e contaminantes em amostras ambientais (Pesticidas, Compostos Orgânicos Voláteis - VOC, Compostos Orgânicos Semi Voláteis - SVOC, Poluentes persistentes, traços de metais pesados, etc.
• Análise de resíduos de drogas de abuso: Cocaína, Metanfetamina, THC e seus metabólitos, etc.
• Análises clínicas: análise de hemoglobina, "screening" neonatal, etc.
• E muitas outras aplicações.

Histórico

1956: Primeiro GC-MS

1974: Primeiro LC-MS

Década de 80: Primeiros sistemas MS para fins amplamente comerciais.

Sistemas de espectrometria de massas podem ser acoplados à sistemas de cromatografia à líquido, sistemas de cromatografia a gás, espectrômetros de emissão atômica por plasma acoplado indutivamente, entre outros.

Para evitar escrever "vários livros", neste artigo trataremos exclusivamente sobre a técnica denominada LC-MS(MS) e suas variações. Em breve escreverei artigos específicos sobre as técnicas de GC-MS, ICP-MS e HR-GC-MS (Setor Magnético).

Mas o que é um sistema LC-MS?

O sistema denominado LC-MS é um dispositivo onde a separação dos compostos ocorre num sistema de cromatografia a líquido e depois é analisado por um detector de massas.

Em acordo com o tipo de analisador de massas acoplado ao sistema de HPLC, a denominação desta técnica pode sofrer variações. Veja alguns exemplos abaixo:

• LC-MS => HPLC + Detector MS do tipo quadrupolo simples
• LC-MS/MS => HPLC + Detector MS do tipo triploquarupolo (Tandem)
• HR-LC-MS/MS => HPLC + Detector MS de Alta Resolução (High Resolution)

Em assim por diante...

Mas lembre-se, todos os sistemas acima, em seu princípio, são sistemas de cromatografia à líquido acoplado (ou hifenado) a um espectrômetro de massas.

Componentes de um sistema LC-MS

• HPLC => Sistema de cromatografia a líquido responsável pela separação dos componentes da amostras antes de serem analisados pelo detector de massas
• Fonte de íons => Responsável pela produção de íons moleculares, seja por ionização em fase gasosa, dessorção ou evaporação.
• Analisador de massas => Tem por objetivo separar os íons moleculares que são produzidos na fonte de ionização de acordo com as diferentes relações massa/carga.
• Detector => É responsável pela identificação dos sinais elétricos produzidos durante o ensaio. Alguns exemplos de detectores são: fotomultiplicadoras, multiplicadora de dinôdo contínuo, "microchannel plate".
• Sistemas de dados => Responsável por interpretar os sinais elétricos identificados pelo detector e transformá-los em picos cromatográficos e uma série de outros "reports" que possam ser analisados e interpretados pelo pesquisador, possibilitando assim todos os trabalhos possíveis em um sistema MS. Existem diferentes softwares disponíveis no mercado para aplicações específicas, como por exemplo: para análise traços, metabolômica, proteômica, etc.

Ok! Mas, de forma geral, como funciona um sistema LC-MS?

Quais os tipos de sistemas de cromatografia podem ser hifenados com analisadores MS?

Você pode utilizar tanto sistemas HPLC convencionais, quanto sistemas UHPLC para hifenar com sistemas de espectrometria de massas.

Com o desenvolvimento de novas colunas analíticas, atualmente, os sistemas de cromatografia a líquido mais utilizados são os do tipo UHPLC, pois a separação dos compostos ocorre de forma mais rápida, o que consequentemente aumenta a produtividade analítica.

Quais as fontes de íons mais utilizadas?

Ionização por Electrospray (ESI)

Vantagens do uso da fonte de ionização do tipo ESI:

• Permite ensaios em amostras não-voláteis;
• Ionização “branda” a pressão atmosférica;
• Análise de compostos de elevado peso molecular;
• Acoplamento com HPLC e eletroforese capilar.

Limitações do uso da fonte de ionização do tipo ESI:

• Espécies multiplamente carregadas exigem transformações matemáticas para interpretação do espectro;
• Não é boa para compostos não carregados, não básicos e de baixa polaridade, como por exemplo, esteróides;
• Muito sensível a contaminantes, tais como: metais alcalinos ou compostos básicos;
• Corrente de íons relativamente baixa.

Ionização Química a Pressão Atmosférica (APCI)

Ionização muito similar à ionização por ElectroSpray (ESI), porém existem algumas diferenças que veremos à seguir.

Principais diferenças entre APCI e ESI:

Mecanismo de Ionização

• Enquanto ESI tem voltagem aplicada à ponta do spray, APCI apresenta um nebulizador aquecido e pneumaticamente assistido. A voltagem (~3 kV) é aplicada a uma agulha de metal na saída do spray. 
• A descarga Corona ioniza as moléculas do solvente que por sua vez ionizam os analitos por transferência de prótons formando [M+H]+ ou [M-H]-.

Fragmentação

• Devido ao uso de aquecimento, APCI pode produzir alguma fragmentação, enquanto que ESI pode até formar alguns íons pseudomoleculares.
• APCI não produz cargas múltiplas, portanto não é adequado para compostos de alta massa molecular.

Sensibilidade

Em geral, as fontes de ionização do tipo APCI tende a apresentar melhor sensibilidade para solutos menos polares. 

Ionização por Dessorção à Laser Assistida com Matriz (MALDI) 

Principais características da ionização por MALDI:

• Processo de ionização branda;
• Apropriado para biomoléculas de elevado peso molecular;
• Pulso de laser incide sobre uma amostra co-cristalizada com uma matriz apropriada;
• Usualmente aplicado à análises proteômica.

Vantagens do uso da fonte de ionização do tipo MALDI: 

• Baixa concentração do analito;
• Velocidade;
• Análise de polímeros e macromoléculas polares e não polares (M>50.000) .

Limitações do uso da fonte de ionização do tipo MALDI:

• Não compatível com LC/MS;
• Difícil obtenção de espectros de MS/MS;
• Deve ser usado com analisadores compatíveis com métodos pulsados (TOF ou FT-ICR).

 

Tabela prática para escolha da fonte de ionização

Quais os analisadores MS mais utilizados?

Quadrupolo Simples

Principais características:

• Analisador de varredura;
• Robusto e com um preço relativamente baixo;
• Conjunto de 4 pólos de sinais opostos, que alternam sinais de radiofrequência entre os pares, permitindo que apenas um íon atinja o detetor de cada vez.

Time of flight - TOF

Principais características:

• O princípio de operação do analisador do tipo "Time of Flight - TOF" envolve a medida do tempo que um íon leva para viajar da fonte de íons até o detector.
• Após ionizada, a identificação é feita com base na diferença de velocidade entre as partículas.

Analisador Orbitrap

Principais características:

• O analisador Orbitrap é um analisador do tipo transformada de Fourier;
• Os íons oscilam em uma freqüência proporcional a relação massa/carga (m/z);
• Apresenta: alta resolução, precisão em massa e taxa de transferência.

Nota 1: Não falei sobre os analisadores do tipo Ion Trap, porque os mesmos estão em queda no mercado analítico. Inclusive vários fabricantes já deixaram de produzir analisadores com esta tecnologia.

Nota 2: Não falei sobre os analisadores do tipo eletromagnético, porque acredito que seja válido escrever um artigo exclusivo para esta técnica.

Detectores em "Tandem"

Com o objetivo de melhorar a performance dos sistemas de espectrometria de massas, as empresas desenvolveram sistemas com detectores em série, usualmente chamados "tandem'.

As principais características de sistemas espectrometria de massas em tandem, são:

• Combina dois ou mais analisadores diferentes ou do mesmo tipo; 
• O primeiro analisador isola os íons de interesse (íon parente ou íon pai);
• Os íons são fragmentados entre o primeiro e segundo analisador através de colisões ou irradiação;
• O último analisador obtém o MS dos fragmentos (íons filho).

Os principais detectores em tandem, são:

Triploquadrupolo (QqQ)

Quadrupolo + Time of Flight (Q-TOF)

Quadrupolo + Orbitrap (Q-Orbitrap)

Maldi + Time of Flight (MALDI-TOF)

Maldi + Orbitrap (MALDI-Orbitrap)

Referências

Wikipédia: Espectrometria de massa

CATALANI, Luiz Henrique. EFL-5922 Espectrometria de massas

Introdução à LC-MS

Espectrometria de Massas - Princípios e Aplicações - Lhaís Leal e Márcia Vieira.