INFORS Aumenta la Produzione di Plasmidi
La domanda di DNA plasmidico (pDNA) è aumentata negli ultimi anni a causa dell’elevata richiesta di terapie geniche e vaccinazioni. Pertanto, è stata fortemente richiesta una produzione aumentata di pDNA con un sistema di purificazione e controllo qualità economico, riproducibile e affidabile. I plasmidi sono tipicamente prodotti nelle cellule di Escherichia coli (E. coli) e successivamente isolati tramite una serie di passaggi di purificazione. Sebbene E. coli produca principalmente l’isoforma superavvolta (SC) più compatta del DNA plasmidico (pDNA), sono solitamente presenti anche isoforme circolari aperte (OC), nicked, lineari e denaturate.
La presenza di diverse isoforme può essere causata da cambiamenti conformazionali che si verificano nell'ospite batterico e durante la lavorazione della biomassa (ad esempio, durante la lisi cellulare) e i passaggi di purificazione del plasmide. Diverse evidenze indicano che livelli elevati di pDNA SC sono necessari per suscitare una risposta immunitaria efficace e, in ultima analisi, proteggere dalle infezioni. Inoltre, l’isoforma SC del pDNA è quella desiderata per la trasfezione, in quanto consente una maggiore efficienza di trasfezione grazie al suo impacchettamento più compatto rispetto alle varianti OC o lineari.
La cromatografia a scambio anionico (AEC) è un metodo comune per purificare il pDNA SC dalle altre isoforme del plasmide e per rimuovere le impurità derivanti dall'organismo ospite. Idealmente, il processo di produzione a monte fornisce già principalmente pDNA SC di alta qualità.
Trasformazione e Coltivazione
Il plasmide pCMV3-GFP (6883 bp), contenente un gene di resistenza all'ampicillina, è stato trasformato in cellule competenti di E. coli NEB 5-alpha seguendo il protocollo del produttore. Il mix di trasformazione è stato placcato su piastre selettive e incubato a 37°C per una notte. Una singola colonia è stata selezionata e una coltura notturna è stata preparata in matracci di Erlenmeyer non baffle da 500 mL con 50 mL di terreno LB e ampicillina. La coltura è stata incubata a 37°C e agitata a 180 giri/min per almeno 18 ore. Per la coltura principale, sono stati utilizzati triplicati di matracci di Erlenmeyer da 250 mL contenenti 25 mL di LB e ampicillina.
Per il confronto, sono stati preparati triplicati di Ultra Yield flasks contenenti 100 mL di Plasmid+ medium, ampicillina e antischiuma. Entrambi i sistemi di coltivazione sono stati inoculati con la coltura notturna con un OD600nm iniziale di 0,2. Le colture sono state incubate a 37°C con agitazione e campionate regolarmente per misurare la crescita.
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Purificazione & Analisi
Il sistema PureYield Plasmid Miniprep (Promega) è stato utilizzato per la purificazione dei plasmidi. Le sospensioni cellulari LB sono state usate non diluite, mentre quelle di Thomson sono state diluite 9 volte. I campioni sono stati centrifugati, e i pellet risospesi in acqua nuclease-free.
Per l'analisi dei plasmidi, è stato utilizzato un sistema HPLC Agilent con una colonna BioPro IEX QF. Il campione è stato eluito usando una fase mobile composta da Tris-HCl con NaCl, con un gradiente applicato nel corso di 30 minuti.
Risultati
La crescita batterica in matracci di Erlenmeyer con terreno LB a 350 min⁻¹ e in Ultra Yield flasks con Plasmid+ medium a 350 min⁻¹ ha mostrato schemi simili fino a 4 ore di coltivazione. Per la coltivazione a 180 min⁻¹, le somiglianze si osservano fino a 8 ore. Nel caso della crescita batterica negli Ultra Yield flasks, la velocità di crescita iniziale è leggermente più lenta rispetto alla coltivazione standard durante le prime ore. Tuttavia, un contrasto evidente tra le due condizioni di coltivazione emerge dopo 4 ore (a 350 min⁻¹) e 8 ore (a 180 min⁻¹).
Per la coltivazione standard, la densità ottica (OD) diminuisce dopo 12 ore, indicando che il numero di cellule vitali è già in declino. Al termine del periodo di coltivazione, i valori di OD del sistema Ultra Yield® mantenuto a 180 min⁻¹ e 350 min⁻¹ hanno superato quelli del sistema di coltivazione standard di oltre 2 volte e 7 volte rispettivamente.
Dopo la purificazione del plasmide, la resa totale del plasmide per la condizione a 180 min⁻¹ era più di 5 volte superiore per i flaconi Thomson rispetto ai matracci Erlenmeyer. Tenendo conto della differenza di volume tra i flaconi, la resa del plasmide era 1,4 volte superiore con il sistema di coltivazione Thomson rispetto al sistema standard. La proporzione di plasmidi super avvolti rispetto a quelli aperti è risultata simile tra i due sistemi, con il 67,7% di plasmidi super avvolti nel sistema Thomson e il 64,7% nel sistema standard.