💡 A Toxicologia do Para-Fluornitrobenzeno: Riscos e Reflexões para a Segurança Química 🌍🧪 Parte 2

Vimos na Parte 1 deste tópico como o p-Fluornitrobenzeno pode gerar preocupações relacionadas à sua toxicidade em: Efeitos sistêmicos e Metabolismo, Risco de Metemoglobinemia e Carcinogenicidade e Genotoxicidade.

Nesta parte 2, trago os principais tópicos de como elaborar uma avaliação de mutagenicidade deste composto, trazendo insights valiosos para a composição da análise de risco de moléculas pontencialmente mutagênicas, tendo como objetivo a correta composição da documentação regulatória de fármacos e IFAs.

1️⃣ Primeiro passo: Revisão bibliográfica

O primeiro passo na composição de uma avaliação de risco é a pesquisa na literatura. Nela, temos informações acerca dos potenciais mutagênicos das moléculas. Vemos se estes dados são confiáveis e se existem testes realizados experimentalmente, e de acordo com as diretrizes da OECD, que podem levar a uma classificação de mutagenicidade sem a necessidade de avaliações in silico. Além disso, esses dados trazem informações primordiais para um embasamento técnico na defesa de não mutagenicidade, se for o caso.

2️⃣ De acordo com o guia M7 do ICH, quando uma molécula possui resultados experimentais considerados confiáveis de seu desfecho mutagênico, não são necessárias outras avaliações. Desta forma, esta revisão pode já trazer a classificação de mutagenicidade de acordo com o guia.

Nos casos em que a revisão bibliográfica não é suficiente para determinar a classificação destas moléculas, o guia indica a utilização de modelos in silico de avaliação de mutagenicidade, no qual deve ser baseado em duas metodologias: Alerta estrutural e Estatística. Há muitos softwares gratuitos que podem ser utilizados que fornecem um resultado, porém, existe um cuidado em usar apenas softwares validados de acordo com as diretrizes da OECD para serem aceitos pelos agentes reguladores. Outro ponto de atenção é sempre investigas o domínio de aplicabilidade destes modelos, uma vez que o resultado pode ser gerado sem a precisão e acurácia balanceada necessárias.

Neste sentido, softwares comerciais, como o Genotox-iS da Altox Ltda., ganham muitos pontos por terem resultados mais precisos e confiáveis, além da avaliação automática de domínio de aplicação. Este fato gera maior segurança para as indústrias farmacêuticas, além de economia de custos, uma vez que o analista ou pesquisador não precisará passar horas ou dias avaliando se a predição obtida está dentro de todas as regras a serem seguidas.

3️⃣ De acordo com alguns artigos científicos e o próprio guia M7 do ICH, pode haver uma avaliação humana das predições por um toxicologista ou pessoa que conheça e entenda tanto de toxicologia como de química. Esta avaliação é extremamente importante pois existem atributos moleculares que minimizam ou potencializam o potencial mutagênico de uma molécula. Além disso, a ciência segue avançando, e por mais que a avaliação in silico englobe (em muitos casos) estas atualizações, a curadoria por um expert pode, com um racional técnico adequado, descartar uma predição e levar a classificação da molécula para uma classe distinta da originalmente predita.

Tendo em vista estes pontos, vamos ver na prática como seria uma avaliação mutagênica adequada?

para-Fluornitrobenzeno

1. Literatura

Ao pesquisar este composto nas bases de dados públicas, vemos que não há estudos in vitro ou in vivo de mutagenicidade e carcinogenicidade que inferem seu potencial mutagênico. Pela IARC, não há indícios de carcinogenicidade em ingredientes ou compostos que carreguem consigo até 0,1% de p-fluornitrobenzeno.

Na literatura científica, vemos alguns indícios de potencial mutagênico nos testes de ames para a molécula. Embora a classe de nitrobenzenos seja majoritariamente negativa para mutagenicidade em estudos de ames, bem como não clastogênicas em ensaios in vivo de troca de cromátide irmã e aberrações cromossômicas.

2. Avaliação In silico

O próximo passo são as investigações. No modelo baseado em regras, temos alerta estrutural. Este alerta é relacionado a moléculas nitro-aromáticas, e resulta em mutagenicidade através desta avaliação. Mas não basta uma predição positiva, o guia M7 do ICH pede também, sempre que possível, o mecanismo de mutagenicidade.

Os compostos nitro-aromáticos podem sofrer redução do grupo nitro, fornecendo um nitro ânion radical que é estabilizado pela ressonância do anel. No p-fluornitrobenzeno, temos ainda o átomo de fluor que é eletronegativo e consegue facilitar essa estabilização ainda mais. Este radical nitro ânion, em ambientes mais anaeróbicos, pode ser reduzido aos grupos nitroso e amina. Com a ativação metabólica, o ânion nitrênio pode ser formado, e este sim é reativo ao DNA.

No modelo estatístico utilizado, gratuito, o consenso entre duas metodologias (vizinhos próximos e clustering hierárquico) resultou em ausência de mutagenicidade. Pontos importantes a se avaliar: Esta molécula está bem representada no training set? Ela está dentro do domínio de aplicabilidade? Os vizinhos próximos são similares?

Utilizando um software comercial, temos todos os atendimentos a este questionamento, e o resultado obtido no modelo estatístico foi de mutagenicidade.

3. Expert review

Então surge a dúvida: Cabe um expert review para refutar o potencial mutagênico?

A resposta é: Depende. Ao utilizarmos o software gratuito, onde temos discordância entre as metodologias a resposta seria sim. Porém, ao utilizarmos um modelo comercial, no qual as duas metodologias convergem no mesmo desfecho, a resposta seria não.

Aqui, cabe a avaliação total: O que diz a revisão bibliográfica? possível mutagênico. O que diz a avaliação in silico baseada em regras? potencial mutagenicidade. E o que diz o modelo estatístico? potencial mutagenicidade. Temos toda a análise convergindo para o potencial mutagênico da molécula, então por lógica e atendimento da regulamentação, esta molécula é potencialmente mutagênica.

4. Classificação

E qual seria a classificação, de acordo com o ICH M7?

Depende.

No caso de refutar o resultado positivo para o alerta estrutural, depende do IFA ou produto acabado a ser avaliado. E por quê? O ICH trás categorias distintas para categorias não mutagênicas: Classe 4 quando o alerta estrutural está relacionado ao IFA e Classe 5 para os casos em que não há alerta estrutural OU o alerta estrutural observado possui base científica suficiente para que seja refutado.

E no caso de acatarmos a mutagenicidade da molécula?

Depende novamente. Classificamos como classe 1 aquelas moléculas que possuem testes in vitro e in vivo positivas para mutagenicidade. Como classe 2, aquelas moléculas que possuem estudos in vitro e in silico positivas. E como classe 3, aquelas moléculas cujos resultados obtidos na avaliação in silico fornecem resultado positivo para mutagenicidade, porém o alerta estrutural não está relacionado ao IFA, e não há dados experimentais apropriados.

Mas, posso classificar como Classe 3? Sim, você pode. Porém o controle desta impureza deverá ser realizado com o TTC apropriado para a molécula.

Muitas empresas, a fim de evitar o controle desnecessário, recorrem ao teste in vitro de mutagenicidade bacteriana (teste de ames) como teste confirmatório. Nestes casos, com o resultado negativo para Ames, o composto pode ser classificado como Classe 5. E caso o resultado para o teste in vitro seja positivo, este deve ser classificado como Classe 2, e controlado até o nível de TTC adequado.

Veja a Tabela de classificação do guia M7 do ICH:

💡 Um ótimo artigo a se consultar para o aprofundamento do expert review pode ser encontrado em: ttps://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0273230016300277#bib55.

Não deixe de se aprofundar mais e entender bem como avaliar uma predição in silico de mutagenicidade!